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今天推荐的思路来自浙江大学第一附属医院发表在Journal of Cellular and Molecular Medicine 的题为“METTL3/YTHDF2 m6A axis promotes tumorigenesis by degrading SETD7 and KLF4 mRNAs in bladder cancer”，即METTL3/YTHDF2通过m6A途径降解SETD7和KLF4 mRNA促进膀胱癌肿瘤发生机制。
首先，TCGA 数据库和 Oncomine 在线数据库中的数据集显示，原发肿瘤中 METTL3 和 YTHDF2 的转录得到促进。此外，在不同的癌症阶段，随着疾病恶性程度的增加，两者均表现出增加的趋势。作者使用了T24、UM-UC-3和SV-HUC-1细胞系来进行western blot实验，结果显示，与正常人尿路上皮细胞系 SV-HUC-1 相比，膀胱癌细胞系 T24 和 UM-UC-3 中 METTL3 和 YTHDF2 的表达确实升高。相关性分析也表明 METTL3 和 YTHDF2 的表达呈正相关
作者用siRNA来降低METTL3的表达，通过CCK-8实验和克隆形成实验发现通过两种不同的siRNA转染METTL3能够降低细胞活性。细胞周期分析发现siMETTL3影响G1期的细胞最为明显。Western blot结果发现与细胞分裂相关的CDK6、CDK4和CCND1在siMETTL3细胞中受到明显抑制。为了研究体内肿瘤增殖，使用基于慢病毒的shRNA技术建立了具有稳定干扰METTL3（shMETTL3-1或shMETTL3-2）和对照（shNC）的UM-UC-3细胞，进行小鼠皮下成瘤实验。结果显示，与感染非靶向 shRNA 对照（shNC）慢病毒的组相比，敲低组（shMETTL3-1、shMETTL3-2）的荧光素酶活性、肿瘤体积和 m6A 水平降低。
作者进一步实验发现METTL3在促进BCa的肿瘤转移中起重要作用。伤口愈合实验和Transwell实验表明siMETTL3能够抑制细胞转移。与此同时，蛋白质印迹分析揭示了 EMT 进展和基质金属蛋白酶家族的表达被抑制。小鼠实验发现，与shNC组相比，shMETTL3-1组和shMETTL3-2组的荧光强度和转移部位数量减少，表明转移受到显著抑制。HE染色和组织切片发现肿瘤细胞在siMETTL3细胞受到抑制。
除了METTL3影响肿瘤细胞迁移等表型，作者又探索了YTHDF2与肿瘤迁移的关系。作者构建了siYTHDF2的膀胱癌细胞，伤口愈合实验和Transwell实验表明siYTHDF2 BCa细胞肿瘤迁移能力受到限制。在表达水平上，沉默 YTHDF2 后观察到迁移率和 EMT 通路相关蛋白和基质金属蛋白酶家族蛋白的表达水平显着降低。过表达 YTHDF2 促进细胞迁移。
作者通过m6A 斑点印迹实验证实在BCa 细胞中METTL3 的过表达提升细胞的总 m6A 水平。为了进一步筛选 METTL3 和 YTHDF2 的分子靶标，对 siMETTL3 细胞中进行转录组测序，选择差异表达的基因并按 P 值排序，这些基因主要富集于 AMPK 信号通路、细胞粘附分子 (CAM)、癌症通路、细胞周期、PI3K-AKT 信号通路等。在鉴定的142 个上调基因（log2FC > 1 和 P 值 <0.05）中，有 46 个基因被预测与 TCGA 数据库中的 METTL3 呈负相关。 整合数据库 LinkedOmics的结果和之前的研究，SETD7和 KLF4被选为主要的有效下游靶标。 作者进一步做了MeRIP测序，与对照组相比，在 METTL3 稳定干扰的 UM-UC-3 细胞中检测到 m6A 特异性抗体的 mRNA 富集显着减少。siMETTL3 增强了 SETD7 和 KLF4 的表达。 RIP实验证实YTHDF2可以特异性免疫出SETD7和KLF4。YTHDF2的识别和直接结合也在蛋白质和RNA水平上得到证明。所有这些发现表明 METTL3 依赖的 m6A 修饰通过 YTHDF2 介导的 mRNA 降解抑制了 SETD7 和 KLF4 的表达。
正如在 TCGA 数据库的分析中观察到的，与正常样本相比，SETD7 和 KLF4 的表达在 BCa 中受到抑制。在不同的癌细胞系中也观察到表达降低。伤口愈合实验和Transwell证实，siSETD7导致迁移活性降低，而过表达SETD7则表现出相反的趋势。这些结果表明SETD7和 KLF4 在膀胱癌细胞是抑癌基因，抑制癌症发生。
最后作者提出了整个调控模型，强调了 METTL3/YTHDF2 m6A 轴对 SETD7 和 KLF4 mRNA 降解在 膀胱癌增殖和转移中的重要性。
2022年度国自然医学部国自然40大科研热点的中标数统计如下：
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