本文选自molecular cell biology
摘要：自2012年该术语被创造出来以来，在过去的几年里，铁死亡的研究领域经历了指数级的增长。这种由铁依赖性磷脂过氧化作用驱动的独特的细胞死亡方式受多种细胞代谢途径的调节，包括氧化还原稳态、铁代谢、线粒体活性和氨基酸、脂质和糖的代谢，以及与疾病相关的各种信号通路。许多器官损伤和退行性病变是由铁死亡引起的。有趣的是，对治疗有抵抗力的癌细胞，尤其是那些处于间质状态并易于转移的细胞，非常容易出现铁死亡。因此，通过诱导和抑制对铁死亡进行药理学调节，在治疗耐药性癌症、缺血性器官损伤和与广泛脂质过氧化相关的其他退行性疾病方面具有巨大潜力。在这篇综述中，我们提供了对目前铁死亡的分子机制和调节网络、铁死亡在肿瘤抑制和免疫监测中的潜在生理功能、其病理作用以及治疗靶向的潜力的批判性分析。重要的是，在所有快速发展的研究领域，由于误解和不适当的实验方法，挑战是存在的。本综述还旨在解决这些问题，并为提高铁死亡研究的可重复性和可靠性提供实用指南。最后，我们讨论了重要的概念和迫切的问题，应该是未来铁死亡研究的重点。
细胞代表生命的基本组织单位。因此，细胞增殖、分化和功能特征，以及最终的细胞死亡在生命的无数表现中至关重要。细胞的命运和功能受到环境和遗传因素的影响。决定细胞命运的最关键的轴之一是细胞如何对氧化应激反应，因为大多数生物在基于还原/氧化(氧化还原)的代谢过程中依赖氧作为最终的电子受体。在导致细胞氧化应激的因素中，膜双层中脂质的氧化修饰——特别是脂质过氧化——已成为细胞命运的重要调节因素，广泛的脂质过氧化通过一种称为铁死亡的独特细胞死亡模式使细胞死亡。现在，铁死亡被认为可能是最广泛和最古老的细胞死亡形式之一:虽然最初是在哺乳动物系统中研究的，但铁死亡样细胞死亡也在进化上遥远的物种中观察到，例如那些属于植物、原生动物和真菌的物种。值得注意的是，脂质过氧化整合了一系列环境和遗传背景，包括热和辐射暴露、代谢、氧化还原稳态和细胞间接触，以及致癌和肿瘤抑制信号。根据对铁死亡的诱导，越来越多的证据表明铁死亡在肿瘤抑制和免疫中的潜在生理作用(图1)。最近，铁死亡还与某些真菌物种的正常发育和线虫的发育老化有关。此外，铁死亡的病理生理学相关性，特别是作为癌症治疗和预防缺血性器官损伤的治疗模式，已经令人信服地建立。
虽然铁死亡这个术语是最近才被提出来的，但在2012年，铁死亡的一些方面或特殊形式很久以前就被观察到了——例如，在20世纪中期的代谢研究中，一种氧化应激诱导的神经元细胞死亡被称为“氧化病”。哈里·伊格尔在20世纪50年代和60年代进行的关于我们现在所理解的铁死亡的开创性工作表明，氨基酸半胱氨酸的缺失会导致细胞死亡，半胱氨酸的内源性合成使细胞对这种细胞死亡具有抗性。现在，我们意识到半胱氨酸是还原型谷胱甘肽的生物合成是限速的。
谷胱甘肽是哺乳动物细胞中最丰富的还原剂，对铁硫簇的生物生成很重要，并且是多种酶的辅因子，包括谷胱甘肽过氧化物酶(GPXs)和谷胱甘肽硫转移酶。对于谷胱甘肽的合成，半胱氨酸可以通过中性氨基酸转运蛋白从环境中吸收，也可以通过xc-胱氨酸/谷氨酸盐反转运蛋白系统(一种包含亚单位SLC7A11和SLC3A2的跨膜蛋白复合物)以氧化形式(胱氨酸)吸收。在本文中被称为系统xc)-或在反式硫化途径中使用甲硫氨酸和葡萄糖合成。已经从遗传学上证明，维持谷胱甘肽合成或促进系统xc-或谷胱甘肽过氧化物酶4 (GPX4)的活性可以保护细胞免受各种氧化应激条件引发的死亡，特别是那些导致硫醇剥夺的条件，将这些早期研究与铁死亡的机制联系起来。
从历史上看，细胞死亡被认为是被动的和不受调节的——直到20世纪70年代发现凋亡是编程性细胞死亡的第一种形式，因为它是由发育编程的途径执行的。调节性细胞死亡的更广泛类别指的是分子调节的死亡程序，但不一定是发育程序。我们现在知道，铁死亡符合这一受调节的细胞死亡标准:它是由致命的脂质过氧化作用驱动的——这是细胞代谢和不平衡的氧化还原稳态的结果——并且可以通过直接阻断脂质过氧化作用或通过药物或遗传手段消耗铁来抑制（铁死亡是一种RCD）。
尽管如此，在许多方面，铁死亡的领域仍然是新生的，在过去的几年里，它只是从氨基酸和脂类代谢、铁稳态、氧化还原和硒生物学以及细胞死亡等邻近领域中融合而来。已发表的关于铁死亡的研究数量呈指数级增长，因此有必要对最近的进展进行彻底和批判性的审视，以便为不同的研究人员群体明确围绕这一主题的关键发现、问题和挑战。在此，我们提供了对铁死亡的机制和调节、其潜在的生理功能及其在疾病和治疗中的作用的深入分析。我们讨论对该领域具有重要概念的新问题和挑战。我们还提供了实用的实验建议，以指导铁死亡的研究。
Mechanisms governing ferroptosis
近年来，在对铁死亡的机理理解方面取得了快速进展。通过系统xc–GSH–GPX4途径在抑制铁死亡中的作用的初步发现，磷脂氢过氧化物(一种基于脂质的活性氧(ROS)形式)作为铁死亡的执行者的作用现已确立(图2)。最近，已经确定了GPX4非依赖性铁死亡监测途径。此外，多不饱和脂肪酸合成的机制——特别是多不饱和脂肪酸(多不饱和脂肪酸的前体)的合成和活化——已经在铁死亡的背景下进行了广泛的研究。重要的是，所有这些研究都集中在细胞代谢上，并揭示了铁死亡和代谢途径之间的密切关系（铁死亡与代谢为起始阶段）。
The key role of GPX4
为了发现新的小分子抗癌疗法，Stockwell 小组从2001年开始进行高通量筛选，并于2003年公布了一系列能够诱导一种独特形式的非凋亡、非坏死性细胞死亡的化合物。反筛选显示多种铁螯合剂和亲脂性自由基捕获抗氧化剂抑制这种类型的细胞死亡。在这种细胞死亡模式中对铁的需求激发了术语“铁死亡”的诞生。随后的机制研究确定了两种细胞成分，系统xc–和GPX4，它们分别被化合物erastin和RSL3抑制，从而导致铁死亡。 GPX4，一种最初由Ursini和他的同事通过生化纯化发现的硒蛋白，是催化哺乳动物细胞中PLOOHs还原(从而解毒)的主要酶。GPX4将磷脂和胆固醇氢过氧化物还原成相应的醇需要GPX4的催化硒代半胱氨酸残基和两个电子，通常由GSH提供，但有时也由其他低分子硫醇，甚至蛋白质硫醇提供。康拉德小组对第一个条件性Gpx4敲除小鼠模型的彻底研究提供了早期证据——在铁死亡被认为是一种独特的细胞死亡方式之前——表明Gpx4的缺失导致小鼠胚胎成纤维细胞脂质过氧化依赖的非凋亡细胞死亡，以及海马和大脑皮质区域的神经退化。这种和其他几种小鼠模型有助于描绘铁死亡体内相关性的更详细的图像，如下文进一步讨论的。
由于GPX4是主要的PLOOH中和酶，erastin/RSL3诱导的铁死亡的一般机制出现了:两种化合物都直接灭活GPX4-RSL3，erastin通过抑制胱氨酸的输入间接灭活GPX4-RSL3，从而剥夺细胞中的半胱氨酸，半胱氨酸是谷胱甘肽的重要细胞组成部分。因此，PLOOHs 积累，可能导致快速和不可修复的膜损伤，导致细胞死亡(图2a)。从概念上讲，这些发现确立了铁死亡是一种细胞死亡方式，其机制不同于其他已知的死亡过程。
Drivers of phospholipid peroxidation
无限制的脂质过氧化是铁死亡的标志。20世纪50年代的早期研究指出了微量元素硒以及维生素E和半胱氨酸对脂质过氧化的抑制作用。脂质过氧化反应的启动需要从结合到脂质双层中的磷脂(PUFA-PLs)中的多不饱和脂肪酰基部分，去除双烯丙基氢原子(位于两个碳-碳双键之间)。这导致形成以碳为中心的磷脂自由基，随后与分子氧反应生成磷脂过氧自由基，从另一个PUFA中除去氢，形成磷脂过氧自由基(图3)。如果未被GPX4转化为相应的醇(PLOH)，PLOO和脂质自由基——特别是PLOO和烷氧基磷脂自由基(PLO)——将与PUFA-PLs反应，通过进一步除去氢原子、与分子氧反应和形成PLOOH来促进PLOOH的产生。最终，这将导致次级产物的形成，包括脂质过氧化物(如4-羟基壬烯醛和丙二酸二酯)的分解产物以及氧化和修饰的蛋白质。这种连锁反应可能最终导致膜完整性的破坏，并最终导致细胞器和/或细胞膜的破裂。因此，含有高PUFA-PL含量的膜特别容易受到过氧化作用的影响，这在神经元中已有证明。与铁死亡过程中发生的脂质过氧化作用相关的精确细胞膜，如线粒体、内质网、过氧化物酶体、溶酶体和质膜中的膜，目前尚不清楚。
基于全基因组单倍体和CRISPR-Cas9的筛选揭示了两种膜重塑酶，酰基辅酶a合成酶长链家族成员4(ACSL4)和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3(LPCAT3)，是铁死亡的重要驱动因素。ACSL4在铁代谢过程中的作用是基于其将长链多不饱和脂肪酸(包括花生四烯酸(20:4)和肾上腺酸(22:4))与辅酶a连接的能力。然后这些产物可以通过各种脂多糖酶重新酯化成磷脂，从而增加长链多不饱和脂肪酸在细胞中向脂质和膜中的结合。ACSL4的遗传缺失或其药理学抑制导致磷脂中长链PUFA尾显著转变为短链和单不饱和脂肪酰基(MUFA)尾。ACSL4缺陷细胞的磷脂膜的这种变化使得它们在Gpx4敲除后能够增殖数月，从而将这些细胞从铁死亡中拯救出来。据报道，外源性补充多不饱和脂肪酸、硬脂酰辅酶a去饱和酶1(SCD1)介导的细胞MUFA产物和ACSL3依赖性膜多不饱和脂肪酸富集可降低细胞铁死亡的倾向。值得注意的是，ACSL4在三阴性乳腺癌细胞亚群中的表达水平与其对铁死亡缺乏诱导剂的敏感性相关，这种相关性似乎与耐治疗的间充质癌细胞和透明细胞肾癌细胞共有。因此，抑制ACSL4表达可能是细胞对铁死亡抵抗的主要机制，抗铁死亡可能受多种信号通路的调节，包括来自细胞间和细胞外基质粘附的信号，这两种信号在肿瘤发展中经常受到影响。相反，ACSL4表达和/或活性的增加可能在各种病理生理环境下促进铁死亡，如缺血-再灌注(一种与铁死亡诱导密切相关的疾病)和对辐射的反应。
尽管毫无疑问，脂质双层的不饱和度是决定细胞对铁死亡敏感性的关键，但关于脂质过氧化实际上是如何引发的，仍有许多不确定性和争论。分隔一对二烯的双烯丙基碳是已知的最弱的碳氢键之一，这些结构数量的增加会加快脂质的自氧化速度，这在环境氧张力下含PUFA的食物的变质中是显而易见的。可以想象，脂质过氧化的非酶引发可以由脂质自由基的自发产生或羟基自由基的产生引发(羟基自由基是活性氧的最具反应性的形式之一，其攻击大多数有机分子，一旦局部产生(由于其接近扩散控制的速率)，可能由使用铁作为催化剂的芬顿反应驱动(图3)。
某些脂氧合酶(LOXs)是针对多不饱和脂肪酸的非血红素铁依赖性双加氧酶，可直接氧化生物膜中的多不饱和脂肪酸和含PUFA的脂质，提高了LOXs可能介导铁死亡诱导的前景。这种可能性得到了以下观察结果的支持:lox的一些药理学抑制剂可以抑制铁死亡敏感性，Alox15敲除或应用LOX抑制剂黄芩素可以保护小鼠免受缺血性脑损伤。尽管如此，在Gpx4敲除背景上遗传性去除Alox15未能防止小鼠成纤维细胞的铁死亡，也未能防止急性缺血性肾损伤和体内相关的致死性，也未能恢复因T细胞特异性Gpx4-/-小鼠中的铁死亡而损失的CD8+ T细胞群。然而，值得注意的是，lox主要与半胱氨酸饥饿诱导的铁死亡有关，而不是由GPX4缺失诱导的铁死亡，因此有必要使用不同的模型进一步剖析lox在铁死亡中的作用。这些数据表明，替代机制可能补偿ALOX15活性的损失，LOXs可能仅涉及铁死亡的某些情况，和/或常用的“LOX特异性”抑制剂作为自由基捕获抗氧化剂发挥非特异性活性，并能够通过这种活性防止铁死亡。事实上，最近的一项研究证实，最常用的LOX抑制剂具有自由基捕获抗氧化活性，从而挑战了LOXs在铁死亡中的普遍作用。此外，所有人LOX同功酶的联合下调未能防止RSL3诱导的铁死亡，尽管它对erastin诱导的铁死亡提供了实质性的拯救，这可能是因为erastin治疗与LOX酶活性有关。因此，LOXs在大多数情况下可能不是铁死亡的关键驱动因素，但在某些情况下可能会导致损伤的发生和/或传播。与此相一致，Alox15或Alox12的缺失分别在神经变性或癌症抑制小鼠模型中显示出保护作用。然而，应该强调的是，这些酶通过产生促炎和抗炎分子直接调节(神经)炎症过程和肿瘤微环境，在免疫系统中发挥重要的生理作用；因此，其损失的有益效果不一定与铁死亡直接相关。与这一概念同样相关的是以前的发现，即GPX4通过所谓的细胞过氧化物酶活性(即细胞中低水平过氧化物的持续维持)控制LOXs的活性和环氧化酶的活性，因为这两种酶都需要通过脂质氢过氧化物氧化其铁来捕获分子氧并将其结合到PUFAs中。值得注意的是，据报道，ALOX12对于由过氧化物触发的p53依赖性铁死亡是必需的，并且这种形式的铁死亡是相当独特的，因为它似乎独立于ACSL4，这意味着p53-ALOX12驱动的铁死亡可能通过不同的脂质起作用，而不是由GPX4缺失或半胱氨酸缺乏驱动的铁死亡。此外，据报道磷脂酰乙醇胺结合蛋白1(PEBP1)与某些lox复合，改变了它们对PUFA-PLs的底物特异性。
除了LOXs在铁死亡中的作用尚不清楚，最近的发现表明普遍表达的细胞色素P450氧化还原酶(POR)在启动脂质过氧化中起作用。在使用NADPH作为电子供体接受来自POR的电子后，下游电子受体，如细胞色素P450和CYB5A被还原，这随后可以通过从多不饱和脂肪酸中除去氢或通过将三价铁(Fe3+)还原成亚铁形式(Fe2+)(图3)直接或间接触发脂质过氧化反应；如下所述，铁和亚铁之间的循环对于芬顿反应和脂质过氧化是至关重要的。
