染色质可及性与分析方法（5）ATAC-Seq

ATAC-Seq

基于转座酶和高通量测序的染色质分析技术(ATAC-seq)是一种新的表观遗传学技术，是一种利用转座酶(改造后Tn5转座酶)来研究全基因组范围内染色质开放性的方法。ATAC-seq是“Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput Sequencing”的缩写，最早是由斯坦福大学的Howard Chang和William Greenleaf实验室的首席研究员Jason Buenrostro于2013年在Nature Methods首次发表。

ATAC-seq是一种研究表观遗传的创新技术，它是一种在全基因组水平上通过高度活跃的Tn5转座酶作为探针，切割DNA序列来定位染色质可及性的方法。

DNA转座是DNA转座子在DNA转座酶的辅助下，从染色体的一个区域转移到另一个区域的现象。DNA转座子要求插入位点的染色质是开放的，对于ATAC-seq而言，同时需要将携带已知DNA序列标签的转座酶人工添加到细胞核中，对开放染色质进行切割，得到带有标签引物的DNA片段，然后再利用已知序列的标签引物对得到的DNA片段进行扩增，构建测序文库。目前，最常用的转座酶是Tn5转座酶，它在可及性染色质上的转座比在不可及染色质上的转座更频繁。Tn5转座酶作为一个探针，通过“剪切和粘贴”机制在全基因组水平上检测染色质的可及性，对于得到的DNA片段可以用测序标签对DNA的未受保护区域进行标记。

在ATAC-seq方案中，包括细胞核制备、转座和扩增3个步骤。首先，将待检查的组织或细胞制备成均一的单细胞悬液，在裂解缓冲液中进行孵育，分离细胞核。其次，将携带已知 DNA序列标签的Tn5转座酶人工添加到500~50 000个分离的细胞核中，Tn5转座酶同时切割DNA并插入DNA序列标签。由于空间位阻，大多数的DNA标签序列被整合到染色质开放区域。将带有转座酶标记的DNA序列进行扩增，以产生用于测序的DNA文库，进行高通量测序。

ATAC-seq基本上依赖于酶反应构建的文库，即转座酶与样品染色质的反应程度，这可能会受到酶的用量、细胞核的数量以及染色质折叠程度和结构的影响。因此，在测序前需要对ATAC-seq文库的质量进行控制，以确保文库浓度达到测序标准。

由于其简单、快速和可重复性，ATAC-seq已迅速成为全基因组范围内染色质可及性分析的重要方法。与其他检测技术相比，ATAC-seq具有许多优点。

第一，  转座酶效率高。通过简单的酶反应就可以实现DNA的断裂、末端修复和接头连接反应，通常在不到2 h内就能够完成对10 000~20 000个细胞的处理。

第二，  第二，灵敏度高。ATAC-seq适合细胞数量有限的研究样本，约500个细胞就能够进行实验。

但是，ATAC-seq技术也存在一些局限。Tn5转座酶进行剪切时，由于每个DNA片段两端的接头是随机的，这导致一段序列两端接头相同的可能性为50%，而只有连接不同的接头序列才能够进行富集扩增和测序，从而会产生一半不能用于富集、扩增和测序的序列。其次，Tn5转座酶倾向于结合和切割转录因子结合区，这导致部分转录因子结合位点信息丢失。此外，由于线粒体DNA的存在，ATAC-seq获得的数据不可避免地包含一些线粒体数据。通过改善裂解条件(Omni-ATAC)、流式细胞术纯化细胞核、或在实验之前应用CRISPR技术切割线粒体核糖体DNA，这一限制因素得到显著解决。

总体而言，ATAC-Seq技术简单快捷，只需要更短的样品准备时间和更少的细胞数量就可以高质量地分析染色质的可及性，识别基因组中活跃的调控序列。ATAC-Seq已用于确定给定细胞环境中的基本可及染色质区域，以及确定两个细胞状态之间的差异可及区域。它迅速应用于干细胞、早期胚胎和各种肿瘤细胞基因表达的动态研究，为揭示染色体可及性、胚胎发育和肿瘤发生的表观遗传机制和潜在的疾病生物标志提供了有意义的见解。

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