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刘慧君刘智程 浙江天科高新技术发展有限公司（原浙江省微生物研究所） 沙门氏菌属(Salmonella)是肠杆菌科中一种重要的人畜致病菌，可引起胃肠炎、伤寒、副伤寒、败血症等疾病[1]。作为一种重要的致病菌，2015版《中国药典》明确将其作为一种控制菌进行检查。药典对沙门氏菌的检测主要分为三步：供试液制备和增菌培养，选择和分离培养，结果判定；主要利用胰酪大豆胨液体培养基的增菌，木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基和三糖铁琼脂培养基的筛菌及显色反应来检测沙门氏菌。但往往在沙门氏菌选择性培养基中会出现杂菌干扰。所以中国药典也强调，在最后三糖铁琼脂培养基上出现沙门氏菌的疑似菌落时，仍需进一步做适宜的鉴定试验[2]。 沙门氏菌选择性培养中出现干扰菌的主要原因为干扰菌有许多生理生化特性和沙门氏菌相似，可利用葡萄糖并且产生酸，还可产生硫化氢，能与培养基中铁盐反应生成黑色硫化铁。近期，实验发现有株菌能够在沙门氏选择性培养基中出现疑似沙门氏菌的理化特性，但是通过进一步鉴定发现是一株弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）。查阅第二版《伯杰氏系统细菌学手册》发现柠檬酸杆菌属和沙门氏菌属有许多相似之处，这也说明了为何柠檬酸杆菌属会成为一种常见沙门氏选择性培养基的干扰菌。 本文对柠檬酸菌属和沙门氏菌属进行了简单的介绍：首先在生理生化特性上对2类菌属进行了大致比较，罗列了它们之间的一些异同之处；然后从16S rDNA序列分析了沙门氏菌属和柠檬酸菌属之间的差异；最后我们从基因组水平上分析了2类菌为何会出现相似的理化反应，探讨调控H2S产生基因（PHS基因）的结构，揭示了部分柠檬酸杆菌属为何会在沙门氏菌选择性培养基出现和沙门氏菌相似理化现象的遗传基础，这对了解和鉴定两类菌具有重要指导意义。 一、沙门氏菌属(Salmonella) 沙门氏菌(Salmonella)是肠杆菌科中一个重要成员，在1885年，由美国兽医师丹尼尔·E·沙门首次分离得到，主要寄生于人和动物肠道内，是一类重要致病菌[3]。大多数沙门氏菌对人和动物都有致病性，目前已成为人类食物中毒的一种重要致病菌，在食品、药品、公共卫生领域都引起极大重视。根据第二部《伯杰氏系统细菌学手册》介绍，沙门氏菌属(Salmonella)，革兰氏阴性杆菌，周生鞭毛运动，兼性厌氧，可利用D -葡萄糖产生气体。多数沙门氏菌都能产生硫化氢，但也有少数血清型的不能产生硫化氢，吲哚实验一般呈阴性，可将柠檬酸盐作为唯一碳源，通常赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶的反应呈阳性，脲酶阴性，一般不能发酵蔗糖、水杨酸、肌醇和杏仁苷，不产生脂肪酶和脱氧核糖核酸酶，具有致病性，可引起胃肠炎、伤寒、副伤寒、败血症等疾病[1]。常见沙门氏菌种有肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）和邦戈尔沙门氏菌（Salmonella bongori），其中肠道沙门氏菌（Salmonella enteritidis）又分为6个亚种，分别是肠沙门氏菌肠亚种（Salmonella enteritidis subsp.enterica）、肠沙门氏菌萨拉姆亚种（Salmonella enteritidis subsp.salamae）、肠沙门氏菌亚利桑那亚种（Salmonella enteritidis subsp.arizonae）、肠沙门氏菌印度亚种（Salmonella enteritidis subsp.indica）、肠沙门氏菌豪顿亚种（Salmonella enteritidis subsp.houtenae）和肠沙门氏菌双亚利桑那亚种（Salmonella enteritidis subsp.diarizonae）[3]。由于沙门氏菌分型繁多，到目前为止已确定的沙门氏菌的血清型就超过2500个[4]。沙门氏菌的致病性和菌产生毒力因子密切相关，其主要的毒力因子有毒力质粒、脂多糖、菌毛等[3]。据统计全球每年有超过1亿人感染沙门氏菌，因此而死亡人数超过15万。尤其在畜牧食品领域发生过许多重大事件，如2018年发生在美国北卡罗来纳州的“毒鸡蛋召回事件”，由于沙门氏菌污染，导致出现22人患病，迫使农场直接召回2.07亿枚鸡蛋[5]。据统计我国细菌性食物中毒中，有70~80%都是由沙门氏菌引起[4]。虽然在药品领域出现沙门氏菌污染事件并不多，但也值得我们加以重视。 二、柠檬酸杆菌属（Citrobacter） 柠檬酸杆菌属（Citrobacter）也叫枸橼酸杆菌属，革兰氏阳性杆菌，属于肠杆菌科，周鞭毛运动，兼性厌氧，是一种常见的肠道细菌，菌落光滑、低凸、湿润、半透明或不透明，呈灰色，表面光滑，边缘整齐，氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性，化能有机异样，多数菌株可利用柠檬酸作为唯一碳源，无赖氨酸脱羧酶，不能分解海藻酸和果胶酸盐，可利用D-葡萄糖发酵产生酸和气体，甲基红测试阳性，VP实验阳性，常见于人和动物的粪便，也可在土壤、水和食物出现[6]。柠檬杆菌属（Citrobacter）最早被人们称为弗劳地埃希菌“Escherichia freundii”，是被包含在埃希氏菌属中，1958年开始被列为独立的菌属，最早只有弗劳地氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)1个种，直到1986年才多出了2个新种[7],[8]。目前伯杰氏系统细菌学手册中收入11个种，包括：弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii），科氏柠檬酸杆菌（Citrobacter Koseri），无丙二酸盐柠檬酸杆菌（Citrobacter amalonaticus），法氏柠檬酸杆菌（Citrobacter farmeri），杨氏柠檬酸杆菌（Citrobacter Younge），布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)，魏氏柠檬酸杆菌(Citrobacter Werkmanii)，塞氏柠檬酸杆菌（Citrobacter sedlakii ），啮齿柠檬酸杆菌(Citrobacter Rodentium)，吉氏柠檬酸杆菌(Citrobacter Gillienii )，默氏柠檬酸杆菌（Citrobacter Murrlinae）。在2015年和2017年，随着研究深入，弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）、杨氏柠檬酸杆菌（Citrobacter Younge）、布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)和魏氏柠檬酸杆菌(Citrobacter Werkmanii)中又发现了Citrobacter pasteurii 和Citrobacter europaeus 两个新种[9],[10]。柠檬酸杆菌属种大多数的菌种都能够在克氏双糖铁培养基和三糖铁培养基中上产生H2S。近年来研究表明，柠檬酸杆菌属部分菌株也具有致病性，可要引起腹泻、败血症、脑膜炎、呼吸道和泌尿道感染等疾病，其主要致病菌种是部分出现在临床的弗氏柠檬酸杆菌株，它的抗原类型和沙门氏菌属具有很高相似性[11]。 柠檬杆菌属除了能够在沙门氏菌选择培养基中生长外，还可在其他培养基中生长，如志贺氏选择培养基，脱氧胆酸盐培养基、亮绿琼脂培养基，亚硫酸铋培养基等[12]。但是并非所有柠檬酸杆菌都能够产生H2S，根据伯杰氏系统细菌学手册介绍，11种柠檬酸杆菌之间生理生化特性存在较大的差异，如下表所示C.farmeri、C. Koseri、C.Rodentium、C.sedlakii无法产生H2S；C. Koseri和C. Rodentium菌种无法在KCN培养基中生长；C.braakii、C.farmeri、C. Koseri、C. Rodentium、C.sedlakii、C.amalonaticus可以利用鸟氨酸；C.Younge、C.braakii、C.farmeri、C.Murrlinae无法利用丙二酸盐；但是研究发现柠檬酸杆菌属11个种都可以利用柠檬酸盐[6]。
注：摘自《伯杰氏系统细菌学手册-Citrobacter》，表中数值是阳性百分率 ；
注：摘自《伯杰氏系统细菌学手册-Citrobacter》，表中数值是阳性百分率； 三、柠檬酸杆菌属和沙门氏菌属生理和生化特性比较 许多研究表明，沙门氏菌属(Salmonella)和柠檬酸杆菌属（Citrobacter）之间生理生化反应有许多异同之处，所以在第二版《伯杰氏系统细菌学手册》的柠檬酸杆菌属这篇中，出现了许多沙门氏菌属的理化介绍。我们通过整理发现，柠檬酸杆菌属和沙门氏菌属主要差异在：吲哚测试、KCN生长、蔗糖利用、乳糖利用、尿素分解、赖氨酸脱羧酶上，其中柠檬酸杆菌属大部分菌种，吲哚测试阳性，可在KCN培养基上生长，另外可以利用蔗糖、乳糖以及分解尿素；而沙门氏菌大多数菌种则吲哚测试阴性，无法在KCN培养基上生长，不能利用蔗糖、乳糖以及分解尿素，但是沙门氏菌属中大部分菌种赖氨酸脱羧酶阳性，而柠檬酸杆菌属是阴性。除此之外，两菌属之间表型有许多重要的相似之处，如大部分菌种氧化酶测试、脂肪酶、苯丙氨酸脱氨酶都呈阴性，能利用柠檬酸酸盐，而且可以利用硫代硫酸盐产生H2S，利用葡萄糖产酸产气等重要理化特性[6]。 2015版《中国药典》中，控制菌检查法——沙门氏菌检查法中，采用木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基和三糖铁琼脂培养基的筛菌及显色来检测沙门氏菌。首先，利用木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基中脱氧胆酸盐钠抑制革兰氏阳性菌的生长来筛菌；然后基于菌种能够产生H2S特性，以及H2S和培养基中的铁盐反应显色来鉴定沙门氏菌。三糖铁培养基中分离鉴定的原理是根据肠杆菌科对糖的利用和硫化氢的产生来鉴定的。三糖是指该培养基中中的乳糖、蔗糖和葡萄糖，大致比例为10:10:1，铁是指硫酸亚铁。沙门氏菌在三糖铁培养基中利用微量葡萄糖，产生少量酸性物质，使培养基先变黄，在接触空气后被氧化又变成红色（另外，沙门氏菌还可利用培养基中含氮物质，生成碱性物质，也可使培养基变成红色，如果菌株能够大量利用乳糖和蔗糖产酸，则培养基菌落会显黄色）。除此之外，一个重要颜色反应是沙门氏菌可利用培养基中硫代硫酸盐和氨基酸类产生H2S，产生的H2S和硫酸亚铁反应生成黑色的硫化亚铁，所以菌落大都呈现边缘红色中间黑色的形态，如下图一，在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上有疑似菌落生长，疑似菌落边缘透明，中心呈黑色，在三糖铁琼脂高层斜面上，斜面红色，底层黄色和黑色。所以，如果有些菌株能够利用葡萄糖产酸，以及能够利用硫代硫酸盐产生H2S，如部分柠檬酸类杆菌，则会在选择性培养基中呈现和沙门氏菌一样的形态。我们对《伯杰氏系统细菌学手册》柠檬酸杆菌和沙门氏菌的特性进行的整理比较发现，所示两种菌属都可以产生H2S，具体如上两表，因此沙门氏菌选择性培养基中出现柠檬酸杆菌属具备合理性。正由于可能出现假阳性结果，药典沙门氏菌检测法中也强调了如果三糖铁培养基中出现疑似沙门氏菌时，仍需要进一步进行其他适宜的鉴定试验[2]。
图一 疑似菌落形态特征 注：木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上的菌落形态（左） 三糖铁琼脂培养基上菌落形态（右）
图二 各菌属基因组进化树分析 图三 16SrDNA序列进化树 三、柠檬酸杆菌和沙门氏菌分子水平比较 柠檬酸杆菌属和沙门氏菌属，除了理化性质上相似外，其整体基因组特性也有一定的相似性，Alyssa M. Walterson 和 John Stavrinides 等人通过将肠杆菌科中各个属内的整个物种群的全基因组的共享蛋白同源物进行构建进化树分析，结果如上图二所示，柠檬酸杆菌属和沙门氏菌最为接近，其次是埃希氏杆菌属，这表明其2类菌的基因组背景较为相似[13]。但是，我们对柠檬酸杆菌属11个种，以及沙门氏菌2个种的16SrDNA序列进行比较发现，其16Sr DNA序列具有许多位点差异，具体如图三的进化树所示，两个菌属可以利用16Sr DNA分开。这说明16S rDNA序列可以用来区分鉴定沙门氏菌属和柠檬酸杆菌属。 沙门氏菌和部分柠檬杆菌属通过代谢产生H2S具有相似的遗传基础。研究表明，沙门氏菌之所以可利用硫代硫酸盐产生H2S，是由于硫代硫酸盐还原酶（Thiosulfate Reductase Gene，PHS）参与其重要活动，编码该还原酶的基因活性受到硝酸盐的影响，如果在培养基中添加10mm硝酸盐，可以阻止菌株产生H2S[14],[15]。为进一步了解PHS基因特点，我们从NCBI上下载4个菌株，分别是：弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii CFNIH1）、肠沙门氏菌（Salmonella enterica ATCC18）、科氏柠檬酸杆菌（Citrobacter KoseriATCC BAA-895）和阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae ATCC 13047），理化研究表明，科氏柠檬酸杆菌和阴沟肠杆菌通常都不会利用硫代硫酸盐产生H2S，而弗氏柠檬酸杆菌和肠沙门氏菌通常都会利用硫代硫酸盐产生H2S。通过全基因组分析发现，弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii CFNIH1）和肠沙门氏菌（Salmonella enterica ATCC18）都拥有三个连续的PHS基因（2个PHS基因较短，1个PHS基因较长），具体见下图四；而科氏柠檬酸杆菌（Citrobacter Koseri）只有一个PHS基因，且片段较短；阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae ATCC 13047）则没有PHS基因。这表明沙门氏菌和柠檬酸杆菌之所以可以利用硫代硫酸盐产生H2S，可能是受到这三个连续的PHS基因调控。 除此之外，我们分离得到一株能够在沙门氏菌选择性培养基中生长，且理化现象疑似沙门氏菌的菌株（我们命名为YSSM），通过16S rDNA序列鉴定为——弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii），进一步对其进行基因组测序和生物信息分析发现，其基因组中也含有3个连续的PHS基因，且和上述2种菌（Citrobacter freundii CFNIH1、Salmonella enterica ATCC18）具有相似的PHS基因结构（2个PHS基因较短，1个PHS基因较长），这表明无论沙门氏菌还是柠檬酸杆菌，三个连续PHS基因可能是利用硫代硫酸盐产生H2S的关键基因。
图四 5菌株基因组PHS基因 5、总结和讨论 综上所述，沙门氏菌属和柠檬酸菌属在生理、生化特性上有许多相似性，如氧化酶测试、脂肪酶、苯丙氨酸脱氨酶都呈阴性，大部分菌种都能利用柠檬酸酸盐，而且都可以利用硫代硫酸盐产生H2S（这也是造成沙门氏选择性培养基出现假阳性的主要原因）。另外两菌属之间也存在许多不同之处，如在吲哚测试、KCN生长、蔗糖利用、乳糖利用、尿素分解、赖氨酸脱羧酶上，其中柠檬酸杆菌属大部分菌种，吲哚测试阳性，可在KCN培养基上生长，另外可以利用蔗糖、乳糖以及分解尿素，而沙门氏菌大多数菌种则吲哚测试阴性，无法在KCN培养基上生长，不能利用蔗糖、乳糖以及分解尿素，但是沙门氏菌属中大部分菌种赖氨酸脱羧酶阳性，而柠檬酸杆菌属是阴性。所以2015版药典中也明确提到，当三糖铁培养基中出现疑似沙门氏菌的菌落时，仍然需要进一步进行适宜的鉴定试验，因为理化特性容易受到外界环境和菌株本身生长状态等多种因素影响，所以不排除假阳性。另外我们发现沙门氏菌属和柠檬酸杆菌属，除了理化性质上有许多相似外，其整体基因组特性也有一定的相似性，Alyssa M. Walterson 和 John Stavrinides 等人通过将肠杆菌科中各个属内的整个物种群的全基因组的共享蛋白同源物进行构建进化树分析发现，柠檬酸杆菌属和沙门氏菌最为接近，其次是埃希氏杆菌属。我们通过比较16S rDNA序列发现，柠檬酸杆菌属下面11个种和沙门氏菌属下面2个种之间有位点差异，进化树分析展示表明，可以利用16S rDNA序列来区分柠檬酸杆菌和沙门氏菌。除此之外，我们对5株菌——弗氏柠檬酸杆菌、肠沙门氏菌、科氏柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌和本实验的YSSM（实际为弗氏柠檬酸杆菌）的基因组分析发现，理论上能产生H2S的菌株，其基因组上都具有三个连续的PHS基因，这可能就是沙门氏菌属和柠檬酸菌属利用硫代硫酸盐产生H2S的关键基因。 参考文献 1、Popoff, Michel Y.; Le Minor, Leon E. (2015): Salmonella[M]. In Whitman (Ed.): Bergey's manual of systematics of Archaea and Bacteria, vol. 91. Chichester, UK: John Wiley & Sons, Inc, p. 1-75. 2、国家药典委员会. 中华人民共和国药典[M].四部.北京:中国医药科技出版社,2015: 147. 3、吕靖.肠炎沙门氏菌SEF21和SEF14菌毛致病作用分析[D].扬州:扬州大学兽医学院,2012:1-61. 4、尹德凤，张莉，张大文等. 食品中沙门氏菌污染研究现状[J].江西农业学报2015,7(11);55～60. 5、刘国信. 沙门氏菌污染与"毒鸡蛋”召回[J].兽医导刊, 2018 ,5:34-36. 6、Frederiksen,Wilhelm (2015):Citrobacter[M]. In William B. Whitman, Fred Rainey, Peter Kämpfer;Martha Trujillo;Jonsik Chun, Paul DeVos etal.(Eds.): Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteriavol. 32. Chichester, UK: John Wiley & Sons, Ltd,p. 1–23 7、赵克义,阚方琦,李景学.柠檬酸杆菌的分类近况[J].中国卫生检疫杂志. 2001,11(2):252-255. 8、何晓青. 柠檬酸杆菌属(Citrobacter)的分类与鉴定[J].中国卫生检验杂志.2005,15(12):1535-1536. 9、Teresa G. Ribeiro, Dominique Clermont,Raquel Branquinho,et al. Citrobacter europaeus sp. nov., isolated from water and human faecal samples[J]. Int J Syst Evol Microbiol. 2017,67:170-173. 10、Dominique Clermont, Laurence Motreff, Virginie Passet,et al. Multilocus sequence analysis of the genus Citrobacter and description of Citrobacter pasteurii sp[J]. Nov.Int J Syst Evol Microbiol. 2015, 65(5):1486-1490. 11、王建升，马展. 费氏枸橼酸杆菌复合群的鉴定及耐药性分析[J].中华医学检验杂志,1998,21(2):106-107. 12、Diana Borenshtein and David B. Schauer. The Genus Citrobacter[M]. Prokaryotes 2006,6:90-98. 13、Alyssa M. Walterson and John Stavrinides. Pantoea: insights into a highly versatile and diverse genus within the Enterobacteriaceae[J]. FEMS Microbiology Reviews , 2015, 39(27):968-984. 14、Sang-weon Bang, Douglas S. Clark, and Jayd. Keasling. Engineering Hydrogen Sulfide Production and Cadmium Removal by Expression of the Thiosulfate Reductase Gene (phsABC) from Salmonella enterica Serovar Typhimurium in Escherichia coli[J]. Applied And Environmental Microbiology, 2000, 66(9):3939-3944. 15、Martaa. Clark And Erickal. Barrett. The phs Gene and Hydrogen Sulfide Production by Salmonella typhimurium[J]. Journal of Bacteriology, 1987,169(6):2391-2397. |
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