|
1.含有活化 STING 的 EV 在受体细胞中诱导 IFNβ 的表达为了研究 STING 是否存在于 EVs 上，作者收集了用或不用 STING 激动剂处理的各种肿瘤细胞的 EVs 和颗粒。有趣的是，STING 激动剂处理能有效激活这些细胞系的 STING 通路，并促进活化的 STING 被包装成 EVP。相比之下，从未经处理的细胞中提取的 EVP 几乎检测不到 STING。重要的是，在与经二氮苯处理的HeLa细胞的EVPs培养的人单核细胞THP-1细胞中检测到了IFNβ的产生，而经二氮苯处理的STING缺失的HeLa细胞则没有检测到IFNβ的产生。当作者构建具有组成型活性 STING 突变的稳定细胞系时，一开始就有大量细胞死亡，但也有少量活性 STING 低表达的细胞能在细胞培养中正常生长；然后这些存活的细胞被用来生产 EVPs。一致的是，从稳定表达这两种活性 STING 突变体的 HeLa 细胞中提取的 EVPs 能诱导 THP-1 细胞中 IFNβ 的表达。在敲除 cGAS 的 THP-1 细胞中，EVPs 对 IFNβ 的诱导没有变化。这些结果表明，EVPs 对 THP-1 细胞中 IFNβ 的诱导是由 EVPs 中活化的 STING 而不是 DNA 引起的。 2.激活的含 STING 的 EV 具有抗肿瘤活性有报道称 STING 可在接受化放疗的癌细胞中被激活， 作者也发现 STING-TBK1 通路在接受各种化疗药物（包括顺铂、阿霉素、芦卡帕利布 、羟基脲 和 5-氟尿嘧啶）以及辐照 治疗的 NCI-H1975 细胞中被激活。此外，经Ruc或IR处理的NCI-H1975细胞产生的EVPs也能刺激THP-1受体细胞中IFNβ的表达，而STING缺失的NCI-H1975细胞中IFNβ的表达减少。更重要的是，在鼻咽癌患者化疗和/或放疗后的血清EVP中，通过Western印迹也检测到了STING。
3.RAB22A 控制含活化 STING 的 MVB 样结构的形成和含活化 STING 的 EV 的分泌接下来，利用作者最近生成的包含 62 个组成型活性 RAB GTP 酶的文库，研究了 STING V155M -HA 与 Flag 标记的 RAB GTP 酶的分布模式，因为 RAB 蛋白调控囊泡的形成、运输和融合。作者发现 STING V155M -HA 定位于 RAB5（RAB5A Q79L , RAB5B Q79L , RAB5C Q113L ）和 RAB22A Q64L 诱导的多囊体样结构中的 ILV 上。值得注意的是，RAB22A WT 也诱导了含有 STING V155M -HA 的 MVB 样结构的形成，而且这些 MVB 样结构比 RAB22A Q64L 在 HeLa 细胞和 NCI-H1975 细胞中诱导的 MVB 样结构更小。为了验证含活化STING的EVs的存在，作者构建了一个L-Flag-STING V155M -GFP质粒，其中根据STING蛋白的结构，将Flag标签插入腔内结构域，并在STING的C端标记GFP。 40 用流式细胞仪对带有强烈L-Flag-STING V155M -GFP信号的细胞进行分拣，收集这些细胞中的EVPs并将其暴露于抗Flag磁珠上。然后，用Flag肽洗脱得到L-Flag-STING V155M -GFP EV悬浮液。 4.活化的 STING 被包装成 MVB 样结构，这种结构依赖于非典型自噬体，而自噬体的形成是由 RAB22A 驱动的活化的 STING 可诱导自噬，STING 具有 LC3 交互区基团，可通过该基团与 LC3 结合。因此，作者探讨了自噬是否能调节活化的 STING 包装成 MVB 样结构。在RAB22A Q64L 驱动形成的MVB样结构中，作者清楚地观察到活化的STING与LC3共定位，而在自噬必需基因ATG5、ATG7或ATG16L1基因敲除的细胞中，活化的STING和LC3均未定位在这些MVB样结构中，这表明活化的STING包装成MVB样结构需要自噬体的形成。此外，在 HeLa 稳定细胞中，STING V155M -HA 和 STING R281Q -HA 的表达导致 LC3-II 水平高于野生型 STING-HA。引人注目的是，STING V155M 和 STING R281Q 都能结合 LC3-II，而野生型 STING 却不能，这种相互作用依赖于 LIR 基序，因为 LIR 突变的 STING V155M/LIR467 不能结合 V5-LC3。STING V155M -HA，而非其野生型和 LIR 突变体 STING V155M/LIR467 ，可在 RAB22A Q64L 的驱动下与 LC3 一起被包装成 MVB 样结构。综上所述，这些结果表明，活化的 STING 被包装进一种非典型自噬体，随后转化为 MVB 样结构。因此，作者将这些 MVB 样结构中由 RAB22A 驱动形成的非典型自噬体内部囊泡衍生的 ILVs 称为 R-EVs，并提出 R-EVs 可能代表一种新型 EV。
5.RAB22A 介导的非典型自噬体与早期内质体融合，发展成拉非体由于 RAB22A 驱动的 LC3 点的形成与活化 STING 驱动的自噬体的形成无关，作者试图研究 RAB22A 介导的非经典自噬体的来源。RAB22A Q64L 诱导的 MVB 样结构与线粒体、高尔基体或 ER-Golgi 中间区室无关，因为在稳定表达 RAB22A Q64L 的细胞中，LC3 与相应的标记物 Tim23、GM130 或 ERGIC-53 没有共定位。有趣的是，LC3 与ER标记物calnexin共定位，而且LC3和calnexin都分布在RAB22A诱导的MVB样结构的ILV上。作为佐证，另一个ER标记物TRAM1也分布在RAB22A驱动的MVB样结构中的ILV上 Q64L。据报道，Brefeldin A（BFA）是一种抑制剂，可通过阻断活化的STING从ER向ERGIC的转位来抑制活化的STING诱导的自噬体的形成。综上所述，这些结果表明 RAB22A 介导的非典型自噬体源自 ER，并与 RAB22A 阳性的早期内体融合成为 MVB 样结构。因此，为了便于描述，作者将 RAB22A 介导形成的自噬体-内体融合结构定义为 Rafeesome，这是一种新的细胞器，可能对活化 STING 的转移至关重要。 6.RAB22A 可使 RAB7 失活，从而使非典型自噬体的内囊泡作为 R-EV 从 Rafeesom 中分泌出来。通过串联 GFP-RFP-LC3 检测，作者发现雷帕霉素（Rapa）诱导的红色 LC3 点是显性的，这表明它们是自溶酶体，其中 GFP 被酸性溶酶体环境淬灭。然而，在过表达 RAB22A 的细胞中，LC3 点主要是黄色的，这表明 RAB22A 介导的非经典自噬体和/或 Rafeesomes 没有与溶酶体融合。事实上，自噬体与溶酶体的融合取决于活性 RAB7 与其效应物 RILP 的结合。 作者发现，在过表达 RAB22A WT 或 RAB22A Q64L 的细胞中，活性 RAB7 减少，而在 RAB22A 基因敲除的细胞中，活性 RAB7 增加。 7.RAB22A 介导的非典型自噬依赖于 PI4K2A 产生的 PI4P最后，作者探讨了 RAB22A 如何参与非规范自噬体的形成。通过敲除规范自噬所必需的基因，作者发现 RAB22A Q64L 介导的非规范自噬依赖于 Atg5、Atg7 和 Atg16L1，而不依赖于 FIP200、Beclin1 或 WIPI2。事实上，在WIPI2基因敲除的细胞中，Refeesomes确实含有LC3，但在ATG7基因敲除的细胞中却没有，RAB22A WT 和 RAB22A Q64L 诱导表达的LC3没有与DFCP1或WIPI2共定位。虽然 Atg16L1、LC3 和 RAB22A 被共定位，但 Atg16L1 并未进入 RAB22A Q64L 诱导的 Refeesomes，这可能是因为 Atg16L1 成熟时会离开自噬体。接下来，作者试图研究 PI4K2A 是否会通过 R-EV 影响活化 STING 的分泌。敲除 PI4K2A 可抑制活化 STING 的分泌，但不影响 4T1 细胞内 STING 信号的传递。此外，敲除 PI4K2A 不影响 4T1 细胞在体外的存活率，也不影响 4T1 肿瘤在正位小鼠模型中的生长，但削弱了 diABZI 对 4T1 肿瘤的抗肿瘤作用。这些结果表明，敲除 PI4K2A 可通过 R-EV 抑制活化 STING 的分泌，从而减弱 diABZI 的抗肿瘤作用。
8.PI4P 直接将 Atg16L1 募集到 ER 衍生膜上，从而促进非规范自噬PI3P 与 WIPI2 结合，WIPI2 随后招募 Atg12-Atg5-Atg16L1 复合物，在吞噬体上生成 LC3-II。在将这一复合物定位到各种膜结构中发挥着关键作用，该复合物在膜结构中催化 LC3 脂化，促进吞噬细胞的形成。RAB22A 介导的非规范自噬体的形成需要 PI4P，而不需要 PI3P 或 WIPI2。值得注意的是，在 PI4K2A 敲除的细胞中，Atg16L1 与 calnexin 的共定位减少，这表明 Atg16L1 招募到 ER 衍生膜依赖于 PI4K2A。SAC1是位于ER上的PI4P磷酸酶；因此作者询问敲除SAC1是否会富集PI4P，导致Atg16L1被招募到ER衍生膜上，并随之增加LC3-II。事实上，作者观察到 Atg16L1 与 calnexin 共定位，并且在 HeLa 细胞中敲除 SAC1 后 LC3-II 增加。然后，作者试图研究 PI4P 如何将 Atg16L1 募集到 ER 衍生膜上。Atg16L1 有一个富含精氨酸（Arg）和赖氨酸（Lys）的多基性区域（aa 211-230），该区域带正电荷，可直接与带负电荷的磷脂结合。因此，作者构建了 Atg16L1 6A，将 Atg16L1 多碱基区内的六个 Arg/Lys 残基突变为丙氨酸（Ala）。不出所料，使用涂有 PI4P 的珠子进行的牵引试验显示，与 Atg16L1 WT 相比，Atg16L1 6A 与 PI4P 的结合能力明显降低。此外，由磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和PI4P组成的合成脂质体与纯化的Atg16L1 WT的结合亲和力比与Atg16L1 6A的结合亲和力强得多。 至此，这篇文章就分享完啦！简单回顾一下：文章开篇详尽地阐述了固有免疫与适应性免疫中ILCs和ILTCs的特性；接下来，作者深入探讨了它们在癌症免疫监控中的核心角色；在第三部分，作者了解到了作为连接适应性免疫与固有免疫的关键桥梁的机制；最后，文章描述了基于ILC和ILTC的免疫疗法及其未来的治疗潜力。这篇文章内容丰富，为作者提供了许多生信分析的研究方向，对于从事免疫研究的朋友们来说，绝对值得一读！ |
|
|
