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1.全基因组 CRISPR 筛选确定 FGFR4 是乳腺癌抗 HER2 抗性的关键基因以曲妥珠单抗为基础的抗 HER2 方案是目前治疗 HER2 阳性乳腺癌的标准方案。因此，作者将曲妥珠单抗敏感的 HER2 阳性乳腺癌细胞株 SKBR3、BT474 和 AU565 在体外持续暴露于曲妥珠单抗 3 个月，生成了抗 HER2 的耐药细胞。抗 HER2 耐药细胞株 rSKBR3、rBT474 和 rAU565 对曲妥珠单抗的 IC50 值较高，且增殖未受干扰，高于各自的亲本细胞株。培养的亲代细胞和用载体或曲妥珠单抗处理的耐药细胞的明视野显微照片见。产生的 rSKBR3、rBT474 和 rAU565 细胞在停用曲妥珠单抗 4 周后仍保持稳定的抗 HER2 能力。此外，体内实验证实，耐药细胞系对曲妥珠单抗治疗有明显的耐受性。为了确定曲妥珠单抗耐药乳腺癌细胞的脆弱性，作者用一个包含 123,411 个 sgRNA 的慢病毒文库对 rSKBR3 细胞进行了全基因组 CRISPR 筛选，该文库靶向 20,914 个人类基因。为确保功能缺失基因筛选的准确性，进行了体外和体内筛选。在这种筛选策略中，携带对存活至关重要的 sgRNA 靶向基因的细胞（即抗性基因）将在曲妥珠单抗治疗条件下被耗尽。经过高通量筛选，在体外和体内选择后分别确定了 1052 个基因和 1032 个基因。其中，几个被鉴定的基因在之前的研究中被报道为强效抗 HER2 耐药基因，证实了作者筛选方法的适用性。在 Metascape 中进一步对这些耐药基因进行了功能和通路富集分析，其中表皮生长因子受体（FGFR）信号转导是参与抗 HER2 耐药的最重要通路之一。作为 FGFR 信号通路的核心家族成员之一，FGFR4 在体外和体内筛选中都名列前茅。FGFR4 是一个可药物治疗的靶点；针对该蛋白开发的首个同类高选择性强效抑制剂是罗布替尼。在治疗肝细胞癌和 FGFR4 高表达实体瘤的 II 期临床试验中，罗布替尼表现出良好的临床疗效和安全性 。因此，作者选择 FGFR4 作为进一步研究的对象，以验证它是否可以作为克服乳腺癌抗 HER2 耐药性的靶点。
2.抑制表皮生长因子受体 4 (FGFR4) 可提高固有和获得性耐药 HER2 阳性乳腺癌细胞系对抗 HER2 治疗的敏感性FGFR4 mRNA在正常乳腺上皮细胞（MCF-10A）和三阴性乳腺癌细胞系中的表达水平较低。与抗 HER2 敏感的 HER2 阳性细胞系（SKBR3、BT474 和 AU565）相比，内在抗 HER2 抗性的 HER2 阳性细胞系（MDA-MB-453 和 MDA-MB-361）的 FGFR4 表达水平更高。同样，获得性抗 HER2 抗性 HER2 阳性细胞系（rSKBR3、rBT474 和 rAU565）的 FGFR4 mRNA 水平也明显高于相应的亲本细胞系。根据癌症治疗反应门户网站（CTRP）数据库，对拉帕替尼（一种抗HER2抑制剂）产生耐药性的细胞具有更高水平的FGFR4表达。为了探索FGFR4在驱动抗HER2耐药性方面的作用，作者在抗HER2敏感的乳腺癌细胞中建立了FGFR4过表达模型。为了更好地模拟小分子抑制剂的作用，作者使用了 dCas9-KRAB CRISPRi 技术来抑制抗 HER2 耐药细胞中 FGFR4 的表达。经 qPCR 和免疫荧光分析验证，CRISPRi 的转录抑制在抑制 FGFR4 表达方面具有极高的效率。作为抗 HER2 体系的基础，作者评估了 FGFR4 干预后曲妥珠单抗的敏感性。抑制 FGFR4 后，曲妥珠单抗耐药性在具有内在耐药性（MDA-MB-453 和 MDA-MB-361）或获得性耐药性（rSKBR3）的细胞中明显逆转。此外，在 SKBR3 和 BT474 细胞系中，FGFR4 的外源过表达也会产生对曲妥珠单抗的耐药性。FGFR4 选择性抑制剂罗布替尼被用于进一步评估。罗布替尼对曲妥珠单抗耐药细胞具有强效抗肿瘤作用。 3.m6A 低甲基化介导抗 HER2 抗性乳腺癌中的 FGFR4 上调为了研究 FGFR4 上调的调控机制，作者检测了 FGFR4 mRNA 水平，以确定转录前和转录后的调控机制。作者发现，用 5-氮杂胞苷（DNA 甲基化抑制剂）或三氯司他丁 A（HDAC 抑制剂）处理后，FGFR4 mRNA 表达保持不变，这表明 DNA 甲基化或组蛋白乙酰化都不是 FGFR4 上调的原因。N6-甲基腺苷（m6A）修饰是细胞内 mRNA 表达的重要转录后调控机制 41,42 。通过点印迹检测发现，与曲妥珠单抗敏感细胞相比，曲妥珠单抗耐药细胞的全局 m6A 水平极度降低。免疫荧光成像和 MeRIP 检测也显示耐药细胞中的 m6A 水平下降，这表明 m6A 水平的下降可能在 FGFR4 上调中发挥了重要作用。作者评估了抗性和亲代HER2阳性乳腺癌细胞中m6A写入剂（甲基化酶）和清除剂（去甲基化酶）的表达。在这些候选者中，METTL14 在曲妥珠单抗耐药细胞中的表达明显下降，这可能是 m6A 水平下降的原因。Western 印迹检测也证实了曲妥珠单抗耐药的乳腺癌细胞中 METTL14 的表达减少。因此，作者推测METTL14的减少导致了HER2阳性乳腺癌中FGFR4表达的上调。METTL14 的低表达与 HER2 阳性乳腺癌的无复发生存率降低有关。敲除 METTL14 能显著提高 FGFR4 在 HER2 阳性乳腺癌细胞中的表达水平。在TCGA数据库中，FGFR4的表达与METTL14呈负相关。为了进一步确认FGFR4 mRNA上确切的m6A修饰位点，作者使用了m6A-Atlas数据库，根据一些MeRIP-seq结果预测m6A基序。荧光素酶报告实验显示，沉默 METTL14 后，野生型 FGFR4 mRNA 组的活性增加，但突变体组没有变化。
4.表皮生长因子受体 4 磷酸化 GSK-3β，从而调节 β-catenin/TCF 信号转导并驱动抗 HER2 抗性为了阐明 FGFR4 如何导致乳腺癌的抗 HER2 抗性，作者对 FGFR4 抑制细胞和对照 rSKBR3 细胞进行了 RNA 下一代测序。总体而言，327 个基因的表达下调，而 374 个基因的表达上调，基于折叠变化 > 2 和 FDR < 0.05。通过 KEGG 富集分析进一步分析了差异表达基因。结果显示，在抗性 HER2 阳性乳腺癌细胞中，WNT 信号通路是 FGFR4 信号转导的一个重要下游靶点。GSEA 也显示了 FGFR4 与 WNT 信号通路之间的强相关性。根据之前的研究，WNT/β-catenin 信号级联的激活显著驱动了乳腺癌的抗 HER2 抗性 。在多种恶性肿瘤中，FGFR4 可直接磷酸化 GSK-3β，从而刺激 WNT/β-catenin 信号转导 。作者发现，在曲妥珠单抗耐药的乳腺癌细胞系中，磷酸化的 GSK-3β 增加，WNT/β-catenin 信号被激活。 5.在抗 HER2 抗性乳腺癌细胞中抑制 FGFR4 后引发铁突变为了进一步明确FGFR4在调节抗HER2耐药性中的生物学作用，作者随后进行了GSEA分析。有趣的是，作者发现 FGFR4 与谷胱甘肽代谢和铁离子平衡有很大关系，而这是铁变态反应的两个核心途径。因此，作者推测，抑制FGFR4可通过触发乳腺癌的铁变态反应来克服抗HER2耐药性。作者进行了一系列实验来评估 FGFR4 敲除后的谷胱甘肽含量和脂质过氧化反应。抑制 FGFR4 后，谷胱甘肽与氧化谷胱甘肽的比例下降。Liperfluo 染色法可观察到脂质 ROS，其数量在 FGFR4 抑制后有所增加。此外，在抑制 FGFR4 后的不同时间段，流式细胞仪显示脂质 ROS 在细胞膜上逐渐积累。C11-BODIPY探针染色显示，FGFR4抑制后氧化脂质与非氧化脂质的比例显著增加，双通道流式细胞仪分析评估发现，铁氧化特异性抑制剂铁锈素-1可逆转这一现象。共聚焦显微镜观察到了 rSKBR3 和 MDA-MB-361 细胞中脂质过氧化的变化。此外，脂质过氧化产物（MDA）的水平在 FGFR4 缺陷细胞中显著增加。透射电子显微镜显示，FGFR4 受抑制的细胞具有明显的铁突变形态特征。线粒体看起来比正常细胞小，膜密度增加，这与之前研究的描述一致。接着，作者用FerroOrange探针和比色法测量了细胞内亚铁离子（Fe 2+ ）的水平。经 FGFR4 抑制剂处理后，可溶性铁库有所增加，这证实了 FGFR4 在铁平衡中的功能。罗格列替尼导致的细胞死亡主要通过与铁前列素-1、脂前列素-1或铁螯合剂去铁胺共同处理而得到挽救，这为罗格列替尼的嗜铁性提供了证据。乳酸脱氢酶（LDH）释放测定显示，铁司他丁-1可逆转FGFR4抑制引起的细胞死亡。 6.FGFR4 通过β-catenin/TCF4-SLC7A11/FPN1 轴加速胱氨酸吸收和铁 2+ 外流为了深入了解FGFR4调控谷胱甘肽代谢和铁离子平衡的具体机制，作者分析了这两条通路的基因表达。作者发现，在抑制 FGFR4 后，胱氨酸转运体编码基因 SLC7A11 和铁转运体编码基因 FPN1（正式名称为 SLC40A1）分别成为谷胱甘肽代谢和铁离子稳态基因集中下调最多的基因之一。这一结果通过 qPCR 和免疫荧光分析得到了验证。与亲代细胞相比，曲妥珠单抗耐药的 HER2 阳性乳腺癌细胞中 SLC7A11 和 FPN1 表达上调。由于 FGFR4 通过激活下游的β-catenin 通路来促进抗 HER2 抗性，作者推测 SLC7A11 和 FPN1 表达的上调是由β-catenin/TCF-4 复合物的转录效应介导的。作者分析了ENCODE公共数据库中TCF-4蛋白的ChIP-seq结果，发现TCF-4在SLC7A11和FPN1基因位点的启动子区域有几个结合峰。JASPAR 网站确定了几个结合元件和基序。然后，进行了 ChIP 检测，以评估 SLC7A11 和 FPN1 启动子区域中潜在的 TCF-4 结合位点。结果显示，SLC7A11启动子3号区（TSS前-1500至-1250）和8号区（TSS前-250至0）是TCF-4抗体富集最多的区域。在 FPN1 启动子中，3 号区（TSS 前 -1500 至 -1250）和 6 号区（TSS 前 -750 至 -500）在 ChIP 检测后被富集。
7.患者衍生模型揭示了 FGFR4 抑制剂对固有和获得性抗 HER2 抗性乳腺癌的疗效FGFR4 抑制剂罗利替尼的抗肿瘤疗效在曲妥珠单抗耐药的固有和获得性乳腺癌模型中得到了进一步验证。首先，rSKBR3 和 MDA-MB-361 肿瘤小鼠分别接受载体、曲妥珠单抗、罗布利尼或联合药物治疗。与曲妥珠单抗治疗组相比，罗利替尼治疗组的肿瘤体积有所缩小。曲妥珠单抗和罗布替尼联合用药对曲妥珠单抗耐药的乳腺癌有协同抗肿瘤作用。IHC染色显示，FGFR4抑制剂可显著降低p-GSK-3β、活性β-catenin、SLC7A11、FPN1和细胞增殖标志物Ki67的水平。为了更好地验证罗格列替尼的疗效，建立了患者来源异种移植（PDX）和类器官（PDO）模型。其中，一个成功的培养模型来自以曲妥珠单抗为基础的新辅助治疗后获得的非CR乳腺癌组织标本，反映了内在抗HER2耐药乳腺癌的生物学特征。另一个代表获得性抗 HER2 耐药乳腺癌的模型是在曲妥珠单抗辅助治疗 18 个月后发现肝转移的患者身上建立的。与载体组、曲妥珠单抗组和罗立替尼组相比，联合治疗组（曲妥珠单抗和罗立替尼）的肿瘤体积和组织重量明显减少。 至此，这篇文章就介绍完啦，总结一下：作者首先详细的介绍了固有免疫及适应性免疫中ILCs和ILTCs特征；第二部分介绍了其在癌症免疫监视中的重要作用；第三部分介绍了连接适应性免疫与固有免疫的桥梁；第四部分叙述了基于ILC和ILTC的免疫治疗，以及未来的治疗前景。全篇知识点丰富，有很多值得作者深挖的生信分析的切入点，做免疫的小伙伴不要错过啦！ |
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