冰冻切片如何做mIHC？

一、前言：

多重荧光免疫组化(mIHC)主要的技术原理来自TSA技术，TSA即酪酰胺信号放大，是一类利用辣根过氧化酶(HRP)对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。用这种方法做多重荧光染色是利用二抗上带有的HRP（而不是直接偶联荧光素），来催化后续添加入体系的非活性荧光素，该荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。然后进行微波处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素还留存在样品上。再换个一抗来第二轮孵育，周而复始。等到所有抗体孵育结束，荧光素都结合好后，最后去检测结果。

因为涉及到多次微波，似乎也只有石蜡切片能经得起这番造作，而手中只有冰冻样本的老师，以往只能望洋兴叹，因为冰冻切片经不起甚至一轮的热处理。但随着技术的发展，这个难题也在逐渐被攻克，为了使得更多老师能够用上mIHC这项技术，Absin推出了抗体洗脱液(abs994)，现在一起来看看冰冻切片的多色实验该如何开展吧~

二、建议操作步骤：

1、样本准备

1）固定包埋：获取新鲜组织，用4%多聚甲醛低温固定，PBS缓冲液洗三次，每次15min；30%蔗糖沉降脱水，OCT包埋；
2）切片：使用冷冻切片机，将组织冰切成3-5μm的切片（对于储存在-80℃下的组织，制备切片前，需转移到-20℃冰箱中平衡约15min），粘贴于防脱载玻片上，室温晾片30-60min。切片放入PBS中浸洗3次，每次5min，去除OCT；
3）淬灭内源性过氧化物酶：滴加3% H2O2，室温下孵育10-30min，PBS浸洗5min×3次。

2、多色实验
1）封闭：滴加封闭液，室温孵育30min，除去封闭液；
2）一抗孵育：弃封闭液，滴加稀释好的的一抗工作液，于避光湿盒内4°C孵育过夜或37℃ 1-2h（湿盒中可加少量水，防止抗体孵育过程干片），PBS浸洗5min×3次；
3）二抗孵育：滴加与一抗相应种属的HRP二抗覆盖组织，避光室温孵育20-50min，PBS浸洗5min×3次；
4）染料孵育：滴加现配的1*TSA染料工作液（使用信号放大液按1:100稀释），反应2-15min，PBS浸洗5min×3次；
5）抗体洗脱：滴加适量37℃预热至完全溶解的抗体洗脱液(abs994)覆盖样本，10s后甩去，再次滴加抗体洗脱液没过整个样本并稍微鼓起，37℃湿盒孵育5-20min（根据切片厚度，一抗种类调整洗脱温度和时间，洗脱难度：结构性膜蛋白和细胞骨架蛋白＞胞浆蛋白＞胞核蛋白），PBS浸洗5min×3次；
6）重复进行[1封闭→5抗体]洗脱过程，直到完成所有指标染色；
7）滴加1*DAPI工作液到样品上，浸没样本区域，室温孵育10min，PBS浸洗5min×3次；
8）滴加抗荧光淬灭封片剂，用盖玻片封片，避免气泡；
9）扫描成像，数据分析。

三、注意事项：

1、若某些抗体难以洗脱，建议降低一抗稀释比例，或将该靶点排到最后一轮进行染色；
2、抗体洗脱液在使用时要根据实际情况调整孵育时间和洗脱温度，若时间太长有可能损伤抗原靶点以及细胞核形态；
3、请在包埋之前先固定样本，切片后固定可能不耐受多次标记与洗脱；
4、冰冻切片请控制切片厚度不超过5um，太厚的样本可能影响染色效果。

虽然抗体洗脱液解决了冰冻切片无法热修复的问题，但多轮洗脱依旧可能存在脱片的情况，可用白片进行多次抗体洗脱判断片子的耐受情况，来决定最终染色的靶点数量。