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在小鼠V1的 L2/3 中，已鉴定出三种转录定义的兴奋性神经元类型，每种类型均以差异表达基因之一命名：Adamts2、Agmat 和Rrad。在这里，作者使用CaMPARI2来标记小鼠视觉皮层第2/3层的神经元。对这些群体进行了单细胞RNA测序，发现先前的Adamts2和Rrad层2/3转录细胞类型分别在驱动负或正预测错误反应的刺激中进行光标记时富集。最后，通过设计用于AAV载体表达基因编码钙指标的人工启动子，在功能上验证了这些结果。因此，可以使用AAV载体靶向的第2/3层中转录上不同的细胞类型表现出可区分的阴性和阳性预测错误反应。体内功能标记可识别皮层中分子定义的细胞类型，Adamts2和Baz1a细胞类型具有不同的预测误差响应曲线，作者设计了人工AAV向量来针对这些预测错误类型。
图一 使用CaMPARI2进行功能标记 作者使用CaMPARI2（一种工程荧光蛋白，只有当细胞内钙水平较高时，紫色照明才能将其从绿色光转化为红色），选择了基于CaMPARI2的方法，而不是双光子靶向光转换方法，因为它在光转换细胞中的产量更高。先前的研究表明，CaMPARI2可以根据体内的活性水平来区分神经元。因此，通过将光转换光与特定刺激同步，可以光标记对该刺激表现出钙反应的神经元。一旦CaMPARI2表达，所有小鼠在虚拟现实环境中都经历了相同的视觉运动范式。小鼠头部固定在一个球形跑步机上，周围是一个环形屏幕。在90 min的过程中，小鼠第一次经历了一个闭环过程，在这个过程中，跑步与环形屏幕上的视觉流反馈耦合。在此过程中，为了驱动负面的预测错误反应，以随机时间内视觉流动的短暂停止的形式引入了视觉运动不匹配。预测错误神经元不能仅用一个刺激来唯一地识别，而且没有一种类型的预测错误会驱动所有的预测错误神经元。对视觉运动相互作用有反应的负性预测错误神经元对视觉运动不匹配表现出强烈的反应，对同一视觉流停止刺激的被动观察没有或有较弱的反应。相反，正预测错误神经元应该由未预测的视觉输入驱动，但当输入可预测时应该响应较弱。在所有的实验过程中，小鼠都可以在跑步机上自由奔跑。接下来，作者通过进行一组单独的实验，测试了视觉运动错配事件下的光刺激是否会优先于光转换错配反应神经元，在这些实验中，测量了CaMPARI2的功能反应以及光转换后的红绿荧光比。当CaMPARI2与钙结合时，其绿色荧光降低，因此CaMPARI2也可以作为钙的指示剂。比较了同一神经元中的光转换水平和钙对视觉运动不匹配的反应。视觉运动错配过程中的光转换优先标记视觉运动错配反应神经元。然后使用三个光转换组中所有分类的细胞进行单细胞RNA测序。
图二 光转换细胞的单细胞RNA测序 作者总共对50,449个细胞进行了测序。所有样本的测序平均读取深度为2.64亿次读取，每个细胞产生4294个独特的分子标识符。使用了生物信息学策略来利用V1发布的参考数据集的能力，该数据集具有更高的读深度用于细胞分类。作者将两个数据集对其他进行对齐，并使用加权最近邻算法将组身份分配给所有细胞。这三种L2/3细胞类型以这三种细胞类型之间存在差异表达的三个标记基因命名。虽然标记基因的表达与细胞类型的身份重叠，但标记基因的表达并不能唯一地识别细胞类型，这三种基因在所有三种细胞类型中都有一定程度的表达。
图三 L2/3兴奋性细胞类型的分配 转录细胞类型是由不是一种表达而是一组基因定义的，这些基因的表达共同构成了细胞类型。将这些差异表达数据中基因的表达模式与参考数据集中的表达模式进行了比较。量化细胞类型分配的相似性，通过计算标记基因的表达模式之间的相关性在作者的数据和参考数据集，发现这些相关性高于所有三种细胞类型。因此，尽管测序深度较低，可以确定数据集中的转录细胞类型身份。推测L2/3兴奋性转录细胞类型可能在功能上有所不同。例如，在L2/3 Rrad型的情况下，在桶状皮质中发现Baz1a阳性神经元对感官刺激有强烈的反应。测试这些细胞类型是否有不同的功能反应属性，数据集中的所有细胞类型中，发现在所有三个高光转换组中，中间神经元都有系统的富集。
图四 不同光转换组中L2/3兴奋性转录细胞类型的差异富集 与在中间神经元中观察到的通常较高的钙活性水平相一致，并强调了重点分析不同光转换组之间的差异富集的重要性。作者只关注L2/3兴奋性细胞，发现Rrad神经元在高视觉光转换组中富集Adamts2神经元在高失配光转换组中富集。
图五 人工启动子在皮层中表现出不同的表达模式 为了证实这些细胞类型也有不同的功能反应，即Adamts2型神经元具有强于平均的错配反应，以及Rrad型神经元具有强于平均的光栅反应，根据3种细胞类型对应的选定标记基因的转录起始位点周围有2 kb的片段，设计了人工启动子。首先使用这些启动子来驱动eGFP的表达，并检测了V1的层流表达谱。成功的候选启动子是L2/3 Adamts2细胞类型的Adamts2基因，L2/3 Agmat细胞类型的Agmat基因，以及L2/3 Rrad细胞类型的Baz1a基因。作者最初尝试用一个基于Rrad基因的人工启动子来标记L2/3 Rrad细胞类型；然而，表达量太弱和非常稀疏。在L2/3中，AP.Adamts2.1阳性神经元倾向于比AP.Baz1a.1阳性神经元更浅，这与V1L2/3深层神经元对视觉刺激更敏感的发现相一致。对于这些启动子，作者比较了高表达和低表达细胞之间的RNA表达谱。为此，首先将分离的组织分类为低eGFP和高eGFP的细胞，然后对这些群体进行批量RNA测序。
图六 人工启动子靶向的L2/3神经元表现出不同的视觉运动反应 Adamts2.1神经元比它们在AP.Baz1a.1和AP.Agmat.1群体中要多。相反，AP.Baz1a.1群体的光栅起始响应强于其他两个标记群体。与视觉流和运动相关输入对负预测错误神经元和正预测错误神经元的相反影响相一致，作者发现AP.Baz1a.1神经元的活动与视觉流速度呈正相关，而AP的活动与视觉流速度呈正相关Adamts2.1神经元与视觉流动速度呈负相关。在与跑步速度的相关性方面，AP.Adamts2.1神经元表现出较强的正相关，而AP.Baz1a.1神经元表现出较弱的负相关。AP.Agmat.1神经元的活动与视觉流动速度无关，而与AP.Adamts2.1和AP.Baz1a.1神经元的运行速度相关。 总之，作者的研究结果表明，分子定义的第2/3层细胞类型具有可区分的预测错误反应。鉴于预测处理已经成为皮层功能的主要理论能够解释神经生理学的结果，以及皮层的功能障碍被认为导致自闭症和精神分裂症，必须有特定的基因访问功能确定神经亚群假设这个框架。不同的预测处理环路模型的实验测试将取决于细胞类型特异性的操作和神经元活动的记录。与此同时，任何涉及预测误差计算的疾病的治疗都可能需要特定细胞类型的干预。此外，操纵L2/3中预测错误类型的能力也可能有助于阐明深层神经元的作用。该研究揭示了小鼠视觉皮层 2/3层的转录特性和计算功能之间的关系。通过他们将体内功能标记、单细胞RNA 测序和细胞类型特异性AAV相结合，证明发出意外刺激信号的神经元在转录上是不同的。  https:///10.1016/j.neuron.2023.08.015 特别鸣谢 |
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