|
联合国糖尿病日——糖尿病用药及其PK/PD研究###  前言 2022年11月14日是第16个联合国糖尿病日，本期主题是“人人享有糖尿病健康管理”。联合国糖尿病日的前身是世界糖尿病日（World Diabetes Day），该活动由世界卫生组织和国际糖尿病联盟于1991年共同发起，从2007年更名为联合国糖尿病日，其宗旨是引起全球对糖尿病的警觉和醒悟。糖尿病在我国是高发病，患上了糖尿病需要终身治疗。因此糖尿病用药的研发对于改善患者生活、减轻疾病负担具有重要意义，而生物分析是糖尿病用药研究进程中不可或缺的一环。 
糖尿病介绍 糖尿病是由于胰岛素分泌及（或）作用缺陷引起的以血糖升高为特征的代谢病。糖尿病的典型症状是“三多一少”（多饮、多食、多尿、体重减轻），出现糖尿病典型症状并符合以下任何一个条件的人，可以诊断为糖尿病[1]: （1）一天中任一时间血糖≥11.1mmol/L(200mg/dl)； （2）空腹血糖水平≥7.0mmol/L(126mg/dl)； （3）口服葡萄糖耐量试验2小时血糖水平≥11.1mmol/L（200mg/dl）。 具备以下因素之一，即为糖尿病高危人群： （1）年龄≥40岁； （2）超重与肥胖； （3）高血压； （4）血脂异常； （5）静坐生活方式； （6）糖尿病家族史； （7）妊娠糖尿病史； （8）巨大儿（出生体重≥4Kg）生育史。 另外，6.1 mmol/L≤空腹血糖（FBG） 糖尿病患者常伴有脂肪、蛋白质代谢异常，长期高血糖可引起多种器官，尤其是眼、心、血管、肾、神经损害或器官功能不全或衰竭，导致残废或者过早死亡。糖尿病常见并发症包括卒中、心肌梗死、视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病足等。 糖尿病用药分类 目前，我国糖尿病分型是根据世界卫生组织在1999年的分型体系来划分的，有4种类型：1型糖尿病、2型糖尿病、特殊类型糖尿病、妊娠期糖尿病。1型糖尿病的主要病因是由于自身免疫对胰岛 β细胞破坏后造成胰岛素分泌的绝对缺乏，故 1型糖尿病患者需要胰岛素治疗来维持生命；2型糖尿病的发生是由于胰岛素分泌减少或是胰岛素抵抗，可表现为以胰岛素抵抗为主伴胰岛素相对缺乏，或胰岛素分泌缺陷为主伴或不伴胰岛素抵抗。治疗糖尿病的药物有胰岛素制剂和口服降糖药。 胰岛素制剂根据其作用时间及特点分类如下【2】： （1）速效人胰岛素类似物。利用重组DNA技术，通过修饰人胰岛素的氨基酸序列而生成的。如门冬胰岛素和赖脯胰岛素。 （2）短效胰岛素制剂，即普通胰岛素。目前有动物来源和重组人胰岛素。 （3）中效胰岛素，即低精蛋白锌胰岛素，是将胰岛素与锌和鱼精蛋白磷酸缓冲液混合制成的混悬剂。 （4）长效胰岛素制剂，即精蛋白锌胰岛素。 （5）超长效胰岛素制剂类似物，有甘精胰岛素和地特胰岛素，具有长效、平衡的特点，无峰值血药浓度。而德谷胰岛素作用时间长达42小时，注射时间灵活，间隔8-40小时均可。 （6）预混胰岛素，是含有短效和中效胰岛素制剂的混合物。 
图1 胰岛素及其类似物的化学结构:(a)人胰岛素；(b)赖脯胰岛素；(c)甘精胰岛素；(d)门冬胰岛素；(e)地特胰岛素；(f)赖谷胰岛素；(g)德谷胰岛素[2] 口服降糖药根据作用机制分类如下： （1）磺酰脲类促胰岛素分泌药，主要选择性地作用于胰岛β细胞，促进胰岛素的分泌，代表药物有格列本脲、格列吡嗪、格列美脲、格列齐特、格列喹酮。 （2）非磺酰脲类促胰岛素分泌药，如瑞格列奈和那格列奈。为新型的短效口服促胰岛素分泌降糖药，促胰岛素分泌作用较磺酰脲类快。 （3）双胍类药，如二甲双胍，可减少糖原生成和增加葡萄糖的外周利用而降低血糖。 （4）α-葡萄糖苷酶抑制剂，如阿卡波糖、伏格列波糖，其在肠道内竞争性抑制α-葡萄糖苷苷酶的活性而减少淀粉的消化和吸收。 （5）胰岛素增敏剂，如罗格列酮和吡格列酮，可改善外周性胰岛素抵抗而降低血糖。 （6）醛糖还原酶抑制剂，如依帕司他，用于糖尿病神经病变。 （7）DPP-IV抑制剂类降糖新药。当人体进餐后，小肠会分泌肠促胰岛素，包括胰高血糖素样肽-1（GLP-1）和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽（GIP）等，促进β细胞分泌胰岛素，从而降低血糖。而血液中分泌的DPP-Ⅳ（肠促胰岛素类二肽基肽酶Ⅳ）会分解GLP-1和GIP，导致肠促胰岛素失效，这种情况在2型糖尿病患者中十分常见。DPP-Ⅳ 抑制剂能够抑制DPP-Ⅳ发生作用，增强和延长活性肠促胰岛素的水平，防止2型糖尿病患者餐后血糖升高。抑制剂类口服降糖新药, 如盛格列汀，可以通过减缓肠促胰岛素的灭活在2型糖尿病患者中发挥降糖作用。 胰岛素类药物国内外研究进展 
图2 胰岛素类药物的发展史[3] 1889年，德国科学家发现移除狗的胰腺，会导致糖尿病，因此首次证明胰腺与糖尿病的相关性。其后从胰岛素的发现、动物胰岛素的提取、再到人胰岛素氨基酸序列的确定仅仅经历了不到五十年的时间。20世纪80年代至21世纪初，胰岛素的研究也经历了历史性的突破进展。通过基因工程技术规模化生产人胰岛素，后又通过对胰岛素结构的修饰或改变其理化性质，开发出了胰岛素类似物，使其更符合生理需要。与此同时，中国药企在胰岛素研究方面也取得了长足的发展。甘李药业、通化东宝、江苏万邦、珠海联邦、宜昌东阳光、合肥天麦等多家公司均在胰岛素赛道上取得不斐的业绩。 胰岛素类药物的代谢排泄 不同类型胰岛素在皮下的溶解、解离、扩散速度不同，导致起效时间、达峰时间、维持时间也有所不同。胰岛素皮下注射后在皮下形成储存池，偏酸性的胰岛素在人体生理偏碱性的环境中会在储存池中形成沉淀，并缓慢再溶解、释放，最终和外周细胞胞膜上的胰岛素受体结合[4]。 胰岛素类药物的代谢途径通常与内源性多肽的代谢途径相同，代谢产生的氨基酸在内源性氨基酸库中被重新利用，用于蛋白质/肽的从头合成。血液、肝脏、肾脏和小肠可能是胰岛素类药物降解的重要部位，因为它们富含各种蛋白酶和肽酶。但由于体内的蛋白酶和肽酶无处不在，体内其他各组织中也都存在多肽的降解。甘精胰岛素会被代谢成M1和 M2，其中M1是最主要的代谢产物。M1和M2均有较弱地与胰岛素样生长因子受体（IGF-1R）结合的能力。 通常情况下，胰岛素类药物的分子量通常都在10 kDa以下，可被肾小球过滤，然后在近端小管细胞刷状边缘被降解，其肾脏清除率接近肾小球的滤过效率。 糖尿病用药的生物分析 药物的治疗成功与否取决于药物的作用机制、患者的依从性以及合适的血药浓度。后两个因素可以通过生物分析方法进行评估。生物分析可以用于确定生物基质中的药物和/或代谢物的浓度，在药代动力学、药效学、治疗性药物监测（TDM）、生物利用度、生物等效性和毒理学研究方面发挥着重要作用。 5.1 胰岛素类药物的生物分析 胰岛素类药物的分析方法根据原理大致可分为三类：免疫分析法、色谱法和电化学生物传感器。免疫分析法包括ELISA, AlphaLISA, HTRF, CLIA，RIA等。色谱法包括MECC（胶束电动毛细管色谱法）和LC-MS/MS。电化学生物传感器是一种基于电流和/或电压检测分析物结合的类型。随着对胰岛素及其类似物或代谢物研究需求的增加，色谱方法也不断地发展，以实现胰岛素与其主要降解产物或其类似物药物之间的充分分辨。本文主要介绍色谱法分析胰岛素类药物。 表·1 基于色谱法的胰岛素测定方法综述[2] 
色谱方法的机制是基于柱分离辅助高效液相色谱（HPLC）或电泳和鉴定使用紫外（UV）检测器和质谱（MS）。分析前不同的样品提取程序也为胰岛素测定提供了不同的选择性和敏感性。LC-MS/MS可用于定量生物基质中的治疗性蛋白/多肽和生物标志物。LC-MS/MS具有特异性高、选择性强、动态范围宽、抗干扰能力强等优点。一般来说，有两种方法来定量蛋白质：自上而下的方法用于研究完整的蛋白质，而自下而上的方法测量蛋白质的酶消化产生的肽。但使用LC-MS/MS检测胰岛素时存在运行时间长和分辨率低的缺点，而UPLC-MS/MS则解决了这个问题。还有文献报道[5]，与RIA相比，UPLC-MS/MS在检测甘精胰岛素及其代谢产物M1和M2时有更高的灵敏度和稳定性，同时还对内源性胰岛素、外源性胰岛素类似物的干扰具有较好的特异性优势。 
UPLC-MS/MS方法的技术难点 该类项目对实验室质谱平台的综合能力提出了巨大挑战： （1）首先是对于仪器系统整体性能、稳定性及灵敏度有很高要求，该类药物质谱多电荷带电，特殊的流动性条件致使信号响应低，所以仪器灵敏度要高且信号稳定，强吸附性需要仪器液相系统硬件有抗吸附功能，否则残留无法通过； （2） 该类化合物吸附性严重，在方法验证及样品分析过程中，仪器清洗维护至关重要，设备管理人员需要敏锐观测仪器信号稳定性，密切配合项目组及时清洗重要配件，才能保证项目顺利开展，如遇到严重吸附污染，则需要仪器厂商高效协同解决； （3） 生物基质干扰严重，需要优选色谱柱，优化良好的梯度条件，与基质中多种干扰物的分离，确保数据科学准确； （4） 色谱柱消耗量大，色谱柱需要老化和平衡冲洗，确保同一PN序列号色谱柱各分析批及不同PN序列号色谱柱重现性及分析批的成功； （5） 样品处理过程需要特殊的方法，提高回收率，保证信号稳定可重现，样品处理全程需要特殊试剂进行抗吸附，否则线性等指标很难成功； （6） 项目运行过程需要高级别项目负责人及操作经验熟练分析人员密切配合才能顺利进行。 经典案例一 甘精胰岛素由53个氨基酸组成，分子量为6063 Da，用于治疗2型糖尿病。在体内可转化为有活性的代谢产物M1和M2。若采用放射免疫分析法，无法区分原型和代谢物。阳光德美质谱平台技术团队采用Waters TQ-XS则可对原型和代谢物进行定量分析。通过设置正离子扫描模式、MRM检测方式以及离子对进行定量检测。另外采用特殊溶剂以解决非特异性吸附的问题。用固相萃取的方法进行前处理，实现了原型和代谢物的灵敏度均达到0.0500 ng/mL。验证结果表明各离子对之间没有相互干扰，特异性好，线性在0.0500~10.0 ng/mL范围内，线性良好，批内批间精密度和准确度均符合要求，没有残留和基质效应，回收率稳定，方法成功地应用于临床样品检测。 
图3 甘精胰岛素质谱图、色谱图和Waters TQ-XS 
图4 甘精胰岛素药时曲线图 经典案例二 赖脯胰岛素属于速效人胰岛素类似物，可以用于治疗1型和2型糖尿病。使用成熟高效的UPLC-MS/MS的检测方法，通过设置正离子扫描模式、MRM检测方式以及离子对进行定量检测。采用特殊溶剂以解决非特异性吸附的问题。采用经开发优化的梯度条件，用固相萃取的方法进行前处理，验证结果表明各离子对之间没有相互干扰，特异性好，线性在0.100~80.0 ng/mL范围内，线性良好，批内批间精密度和准确度均符合要求，没有残留和基质效应，回收率稳定。 
图5 赖脯胰岛素药时曲线图[6](Ly-Lis-JP为参比制剂优泌乐，SAR-Lis为受试制剂） 表2 赖脯胰岛素PK/PD结果[6] 
5.2 口服降糖药的生物分析 口服降糖药一般可以采用HPLC-MS/MS进行检测。液质联用技术是将色谱分离技术与质谱检测技术两者相结合，兼具色谱的分离能力和质谱的高灵敏度、高特异性以及抗干扰能力强等特点，可以应对多种复杂组分的快速检测、鉴定和准确定量，使其在药代动力学研究领域得到了广泛的应用。据文献报道[3]可在同一色谱系统同时检测二甲双胍、格列喹酮、格列美脲等11种降糖类化合物。 经典案例三 盛格列汀作为肠促胰岛素类二肽基肽酶Ⅳ（DPP-Ⅳ）抑制剂类口服降糖新药,可以通过减缓肠促胰岛素的灭活在2型糖尿病患者中发挥降糖作用，前期试验数据表明盛格列汀在2型糖尿病中的疗效可期，安全可靠。阳光德美开发并验证了具有高灵敏度、高特异性的高效液相色谱-质谱/质谱（HPLC-MS/MS）定量分析方法，分别测定人血浆、尿液、粪便样本中磷酸盛格列汀原型药物和阳性对照药物（西格列汀）的浓度。因盛格列汀属于I类新药，方法开发难度大，项目负责人通过查阅大量同类药物相关文献，结合临床前相关资料，推断新药系统暴露，顺利完成方法开发及符合国内外法规要求的方法学验证，并应用于临床研究，为后期临床研究提供数据支持，为阐明盛格列汀系统暴露与药效的关系研究提供科学参考。盛格列汀的代谢产物互为同分异构体是其代谢的一大特点，同时也增加了分析的难度。阳光德美采用高分辨质谱Q-TOF，凭借着丰富的质谱解析经验，对盛格列汀存在于人血浆、尿液、粪便样本中共11个代谢产物进行鉴定，并推断出了可能的质谱裂解途径，从而总结了盛格列汀在人体内主要的代谢途径，为解释盛格列汀药效研究和安全性评价的物质基础提供科学依据。 
在盛格列汀项目运行过程中，德美医药进行了有效的项目管理和积极地沟通，不分节假日，做到生物样品随到随测。为尽早对药物剂量组的安全性和受试者的耐受性进行药学分析，指导后期试验的剂量选择争取时间，快速高效的完成盛格列汀的I期临床研究工作，极大推进了盛格列汀的研发进程。 德美医药通过临床定量药理模型，合理预测了盛格列汀开展Ⅲ期临床可能的临床推荐剂量，使得其于2019年11月得到国家药品审评中心的“豁免II期临床直接进入III期试验”的正式批复，成为全球首个通过定量药理模型，豁免II期临床，直接开展Ⅲ期验证性试验的DPP-IV抑制剂，受到了国内外糖尿病领域专家的高度关注。 结语 近年来，随着糖尿病研究的不断深入以及新药的研发，极大地改善了糖尿病人群的生活。相信在不远的未来，会有越来越多优秀的降糖药物出现，为患者提供更多更好的治疗选择。全面了解降糖药物的生物分析，对于设计更好的降糖药物和更好地控制不良反应具有重要意义。 阳光德美在2019年开始建立肽类药物及核酸类药物PK、PD、ADA研究服务平台，从软硬件建设，人员团队能力建设，质量体系建设，项目管理等多维度下功夫，目前已成功开发并实际应用I期临床研究中多种肽类药物方法、反义核酸药物方法，包括在胰岛素类药物的生物分析方面有着丰富的经验。目前在肽类药物及核酸类药物方面服务于国内胰岛素头部企业，国内大型综合型药企的核酸平台品种及多家新型Biotech肽类企业。阳光德美一直秉持着“质量是阳光德美的立身之本，效率是阳光德美的强身之道”的信念。在未来的发展中，阳光德美将一如既往地以科学、高效、准确的精神为指导，领先行业、创誉中外，与社会各界朋友精诚合作，携手奋进，共创生物样品分析领域更加辉煌的明天。 |
|
|
