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编者按 脑小血管疾病（CSVD）是导致卒中和血管性痴呆的最重要原因之一1，因此有必要探索治疗CSVD的有效方法。本研究探索了依达拉奉右莰醇（C.EDA）在CSVD模型中的抗炎作用。研究结果速览：
研究背景 CSVD具有高隐蔽性、高发病率和高致残率的特点，全球有45%痴呆病例由其导致，且CSVD会导致全脑功能下降2。痴呆症患者可能会在轻度至中度阶段死亡，因此CSVD是一个亟需需解决的全球健康问题。然而，CSVD的发病机制十分复杂，尚未完全阐明。 小胶质细胞是卒中后神经系统免疫防御的第一道防线，参与组织损伤或损伤修复。小胶质细胞激活时获得两种状态及功能不同的表型：M1表型和M2表型。极化为M1表型的小胶质细胞，释放诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素（IL）-6等炎性细胞因子，导致炎症损伤。相比之下，极化为M2表型的小胶质细胞则表达抗炎细胞因子，如转化生长因子-β（TGF-β），IL-10等，有助于大脑功能恢复。据报道，核因子kappa-B（NF-κB）信号可调控小胶质细胞的极化，而肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）在此过程中可通过泛素化激活NF-κB通路。芳香烃受体（AHR）通过TRAF6参与调节NF-κB信号的激活点3。 有研究表明，慢性炎症和神经退行性病变贯穿CSVD的整个病理过程4。既往研究显示，C.EDA在缺血性卒中动物模型中可发挥抗炎和抗氧化作用，临床对照试验中也表现出了明显优于单用依达拉奉的疗效，而患者主要受益于其抗炎作用。对此，本研究探讨了慢性疾病模型中，C.EDA是否可以通过其抗炎活性发挥脑细胞保护作用？C.EDA是否可以减轻CSVD导致的残疾并使大多数患者受益？以及C.EDA未来是否具有良好广阔的应用前景？ 研究设计 研究将小鼠随机分为5组：（i）正常组、（ii）假手术组（假手术小鼠）、（iii）模型组（双侧颈动脉狭窄（BCAS）模型小鼠）、（iv）模型+安慰剂组（生理盐水治疗的模型小鼠）、（v）药物组（C.EDA治疗的模型小鼠）进行数据对比分析。 研究结果 BCAS模型小鼠在Morris水迷宫任务中表现出认知障碍 通过计算改良神经功能缺损评分（mNSS）、强迫游泳实验（FST）、Morris水迷宫测试（MWM）来评估小鼠的运动能力、情绪障碍程度和认知功能障碍。结果显示，在空间探索测试中，模型组小鼠找到并爬上平台的时间长于其他两组（图1A）。与正常组相比，模型组小鼠穿越目标平台的次数显著减少（P=0.0656，正常组vs.假手术组；P=0.0035，正常组vs.模型组；P=0.4552，假手术组vs.模型组，图1B）。通过训练，正常组和假手术组小鼠采用了经典的空间定向搜索策略，而模型组的小鼠则采用了漫无目的的搜索策略（图1C）5。    图1. BCAS小鼠在Morris水迷宫任务中表现出认知障碍 A.空间探索测试中记录的逃离延迟时间。B.在空间探索测试中计算穿越目标平台的次数。c.空间探索测试中小鼠的代表性跟踪图像。正常组小鼠n=8，假手术组小鼠n=7，模型组小鼠n=8。所有值均为平均值±SD，*P<0.05。 BCAS模型小鼠BBB破裂、神经元缺失、髓鞘损伤及胶质细胞过度增殖 小鼠的大脑表现出多种病理变化。通过伊文思蓝（EB）染色来评估BBB功能障碍，结果表明与正常小鼠相比，模型小鼠的大脑细胞膜的完整性受到了破坏（图2A）。苏木素-伊红（HE）染色显示，模型小鼠的大脑皮层细胞明显肿胀，排列松散，细胞核明显萎缩（图2B）5。 同时，尼氏（Nissl）染色（图2C）和神经元组织化学（图2D）观察到神经元数量减少。通过劳克坚牢蓝（LFB）染色，仅模型组显示出明显的脱髓鞘迹象（图2E）5。 检测到模型小鼠皮质中小胶质细胞的增殖，Iba1免疫标记阳性的小胶质细胞的数量密度在BCAS后显著增加（P=0.8514，正常组vs.假手术组；P=0.0037，正常组vs.模型组；P=0.0023，假手术组vs.模型组，图2F）5。     图2. 早期BCAS模型的各种病理特征 A.典型的EB彩色图片。B.具有代表性的HE染色图像。C.Nissl染色的代表性照片。D.神经的代表性组织化学图像。E.典型的LFB染色图像。F.Iba1的代表性组织化学图像。正常组小鼠n=8，假手术组小鼠n=7，模型组小鼠n=8。比例尺：B-F中为25μm。 BCAS模型中AHR/NF-κB信号通路的激活可调节小胶质细胞的极化 基于小胶质细胞激活在CSVD神经炎症中的重要作用，研究通过定量逆转录聚合酶链反应（QRT-PCR）和蛋白质印迹分析探讨了BCAS模型中小胶质细胞极化状态和细胞因子表达的变化。M1小胶质细胞释放的TNF-α和IL-6的表达水平升高（图3C）。同时，M2小胶质细胞释放的TGF-β1和IL-10水平明显降低（图3D）5。 基于NF-κB通路在多种神经退行性疾病中调节小胶质细胞的极化，研究检测了NF-κB通路分子和潜在调节因子AHR的表达。在模型组中，pNF-κBp65和pIκBα水平显著升高（分别为P=0.6461，正常组vs.假组；P=0.0006，正常组vs.模型组；P=0.0003，假组vs.模型组和P=0.9937，正常组vs.假组；P<0.0001，正常组vs.模型组；P<0.0001，假组vs.模型组），而AHR、TRAF6，NF-κBp65和IκBα的水平下降（图3E-G）5。    图3. AHR/NF-κB信号通路参与调节BCAS后大脑皮质M2小胶质细胞表型极化 （左右滑动查看下一页） E-G.炎症细胞因子（TNF-α、IL-6、TGF-β1和IL-10）和相关通路分子（AHR、TRAF6、IκBα、pIκBα、NF-κBp65和pNF-κBp65）的蛋白水平。正常组小鼠n=8，假手术组小鼠n=7，模型组小鼠n=8。所有值均为平均值±SD，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。 C.EDA可促进小鼠小胶质细胞（BV2）在体外向M2表型极化 为评估C.EDA的抗炎作用，研究分别用不同浓度的C.EDA处理BV2细胞。研究发现,在C.EDA浓度为0.25ug/mL和2.5ug/mL时，与对照组相比，M2表型标记物CD206和AHR的表达水平显著升高[（分别为：P=0.0078,对照组vs.C.EDA（0.25μg/mL）；P=0.0248对照组vs.C.EDA（2.5μg/mL），图4A和P=0.0181,对照组vs.C.EDA（0.25μg/mL）；P=0.0163,对照组vs.C.EDA（2.5μg/mL）图4B）]，而在C.EDA浓度为25ug/mL时，其表达下降5。  图4. C.EDA对体外BV2细胞极化的影响 （左右滑动查看下一页） A和B.在0.25μg/ml和2.5μg/ml浓度下，CD206和AHR的表达量显著增加。所有值均为平均值±SD，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。 C.EDA通过减少神经元缺失和髓鞘损伤，改善BCAS小鼠的认知功能障碍 为确定C.EDA对CSVD的具体影响，研究通过MWM评估了五组小鼠的认知功能。在空间探索测试中，与模型组和安慰剂组相比，药物组穿过目标平台的次数显著更多（P=0.0316，模型组vs.药物组；P=0.0316，安慰剂组vs.药物组，图5A）。药物组采用了经典的空间定向搜索策略，与正常组和假手术组所采用的策略类似5。 通过单独的HE染色和Nissl染色检测，正常组、假手术组和药物组的大脑皮层细胞均未发现明显的细胞肿胀或核脓肿，神经元数量也无明显差异（图5B）。用LFB染色显示，与正常组和假手术组相比，药物组无明显的脱髓鞘增加迹象（P=0.7857，正常组vs.药物组；P=0.0860，假手术组与药物组，图5C）5。 图5. C.EDA治疗BCAS后减少神经元缺失、髓鞘损伤，改善认知功能 （左右滑动查看下一页） A.计算目标平台跨越时间。B.Nissl染色面积。C.LFB相对染色面积。正常组小鼠n=8，假手术组小鼠n=7，模型组小鼠n=8，安慰剂组小鼠n=8，药物组小鼠n=8。所有值均为平均值±SD，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。 C.EDA通过NF-κB途径促进小胶质细胞向M2表型极化，从而减轻认知障碍 研究检测了参与炎症过程和相关调节途径的分子表达变化，以验证C.EDA的神经保护作用。药物组CD206的表达与假手术组无显著差异；但模型组和安慰剂组CD206的表达明显下降。相应地，M1小胶质细胞释放的细胞因子，如TNF-α的表达水平下调，而IL-6的表达水平则不受C.EDA治疗的影响。与模型组和安慰剂组相比，使用C.EDA治疗后，M2小胶质细胞释放TGF-β1和IL-10表达上调。C.EDA促进了AHR的表达，但抑制了TRAF6的泛素化以及NFκBp65和IκBα的表达，增加了pNF-κB的表达，降低了pIκBα的表达（图6A-F）5。 图6. C.EDA对小胶质细胞极化及相关AHR/NF-κB信号通路的影响 （左右滑动查看下一页） A-D.蛋白质印迹分析小胶质细胞标记物（Iba1和CD206）炎症细胞因子（TNF-α、IL-6、TGF-β1和IL-10）和相关通路分子（AHR、TRAF6、IκBα、pIκBα、NF-κBp65和pNF-κBp65）的蛋白水平。正常组小鼠n=8，假手术组小鼠n=7，模型组小鼠n=8，安慰剂组小鼠n=8，药物组小鼠n=8。所有值均为平均±SD，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。 研究结论 本研究通过构建BCAS模型，探索了调节小胶质细胞极化的潜在机制以及治疗伴有痴呆症的CSVD的有效方法。行为学数据显示，BCAS模型小鼠表现出严重的认知功能障碍。病理染色表明，BCAS模型小鼠存在BBB破裂、小胶质细胞增殖、神经元缺失和髓鞘损伤。体外实验结果证明，C.EDA能促进小胶质细胞向M2表型极化。此外，体内实验结果进一步表明，C.EDA增加了AHR的表达，阻止了TRAF6的泛素化，促进了NF-κB RelA/p65蛋白降解，抑制了NF-κB通路的磷酸化，从而在机理上使小胶质细胞向M2表型极化，在功能上改善了认知功能且对患有痴呆症的CSVD有益，综上所述表明C.EDA具有良好的应用前景。 仅供医疗卫生专业人士阅读 作者：YMT； 审校：薛群教授，陈丹璐，张莉娟，颜爱竹，曹嵩； 美编：王贤； 正文图片：改编自原文； 参考文献 1. van Veluw SJ, et al. Neuropathology of Vascular Brain Health: Insights From Ex Vivo Magnetic Resonance Imaging-Histopathology Studies in Cerebral Small Vessel Disease. Stroke. 2022 Feb;53（2）:404-415. 2. Wardlaw JM, et al. Cerebral Vascular Dysfunctions Detected in Human Small Vessel Disease and Implications for Preclinical Studies. Annu Rev Physiol. 2022 Feb 10;84:409-434. 3. Shen GH，et al. Edaravone dexborneol alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury through NF-κB/NLRP3 signal pathway. Anat Rec （Hoboken）. 2023 Jul 20. 4. Gao Y, et al. Cerebral small vessel disease: Pathological mechanisms and potential therapeutic targets. Front Aging Neurosci. 2022 Aug 12;14:961661. 5. Li L, et al. Edaravone dexborneol ameliorates cognitive impairment by regulating the NF-κB pathway through AHR and promoting microglial polarization towards the M2 phenotype in mice with bilateral carotid artery stenosis （BCAS）. Eur J Pharmacol. 2023 Oct 15;957:176036. |
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