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一、革兰染色的操作步骤 1 涂片 取洁净载玻片1张，加一小滴无菌水，将接种环在火焰上烧红，冷却后挑取少量标本或纯培养的菌落直接涂片混匀后，涂成直径为10-15mm稀薄而均匀的圆形菌膜。干燥后将玻片正面向上在酒精灯微小火焰上通过2或3次，使细菌固定于玻片上，以玻片触及手背皮肤热而不烫为宜。 2 实验步骤 加结晶紫液染色60s，之后水洗，甩干；媒染：加碘溶液染色60s，之后水洗，甩干；脱色：加脱色液脱色30-45s，之后水洗，甩干。复染：最后加沙黄溶液复染30-60s，之后水洗；以滤纸吸干或在空气中干后，用油镜做镜检。染成紫色为革兰阳性菌，染成浅红色为革兰阴性菌。 二、结果判断 1）葡萄球菌：呈紫色球形葡萄状为革兰阳性。 2）肺炎链球菌与乙型溶血性链球菌：呈紫色链状为革兰阳性，有部分菌体呈革兰阴性，被染成红色，部分有荚膜，乙型溶血性链球菌长时间培养物易为革兰阴性。 3）铜绿假单胞菌、大肠埃希菌呈革兰阴性杆状被染成红色。 4）鲍曼不动杆菌呈革兰阴性球杆状被染成红色为革兰阴性，但常会出现紫色球形革兰阳性菌的特点。 5）枯草芽孢杆菌：深蓝色菌为革兰阳性，部分菌体出芽孢，有一部分菌体呈革兰阴性被染成红色。 6）假丝酵母菌：呈紫色为革兰阳性。 三、革兰染色的临床意义 1）确定细菌的染色性、形态，如球菌、杆菌、弧菌等。 2）有芽胞的杆菌和绝大多数的球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈阳性；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈阴性。 3）细菌性脑膜炎、肺炎、菌尿、淋病、脑、肺、腹部的感染和创伤时，革兰染色非常有用。例如疑似细菌性脑膜炎和关节炎患者的检样直接涂片染色发现病菌，可在获得培养结果前提供病原的参考；泌尿生殖道的检样，若发现革兰阴性双球菌，可作为诊断淋病的参考；女性阴道直接涂片，根据乳酸杆菌在镜下视野中的比例，有无滴虫或念珠菌的假菌丝和芽生孢子，可判断细菌性、念珠菌性或滴虫性阴道炎。 4）分离培养的菌落，细菌鉴定的第一步为革兰染色，根据染色性和形态，来确定下一步再做哪些试验。 5）在获得药敏结果前，革兰染色可作为医师选用抗生素的参考，革兰阳性菌对青霉素类抗生素敏感，革兰阴性菌对氨基糖苷类抗生素敏感。 四、革兰染色的影响因素 有时会出现染色结果异常，如葡萄球菌被染成红色，大肠杆菌被染成紫色，这样葡萄球菌则变为革兰阴性菌，大肠杆菌变为革兰阳性菌，可能存在如下因素： 1 操作时取菌不当或涂片不够均匀 如取菌过多造成菌膜过厚，在脱色时就不能将第一步染上的结晶紫的颜色脱去，镜检视野呈一片紫黑色，误认为革兰阳性菌。玻片上细菌涂布不均匀，造成标本片上菌膜厚薄不一，染色后镜检，视野明暗不一，细菌成团，无法分辨。 2 固定方法不当 如果将玻片在火焰上烤得太久，改变了细菌原有的通透性，会使细菌的染色性发生变化，影响染色结果。 3 染色时间控制不当 1）阳性菌透性小，不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色。如果结晶紫液染色时间过长、酒精脱色时间过短，则使革兰阴性菌呈紫色或紫红色； 2）结晶紫液染色时间过短、酒精脱色及稀释复红染色时间过长，均可导致革兰阳性菌呈红色或紫红色。 3）脱色时间延长对革兰阳性菌的染色结果影响较大，对革兰阴性菌的染色结果无影响；脱色时间缩短只对革兰阴性菌的染色结果影响较大，对革兰阳性菌的染色结果无影响。 4 染色液问题 如果碘液放置时间太长，或经日光照射失效，失去媒染剂的作用，就可能使结晶紫与细菌结合得不牢固，菌体不易着色，颜色偏淡，使革兰阳性菌染成革兰阴性菌，不易判断结果；存放时间较长的结晶紫浓度太高，染上的颜色不容易被酒精脱色，可能会使革兰阴性菌染成革兰阳性菌。 5 细菌因素 不同细菌的革兰染色性与形态因培养时间而有所变化。如4-6h培养物的革兰染色性好，24h后培养物的革兰染色性差，变成了老龄菌，特别是有些菌体轮廓不清晰，可能会使革兰阳性菌染成革兰阴性菌。如培养4h的肺炎链球菌已经有部分菌体呈革兰阴性，24h后革兰阴性的菌体明显增多。乙型溶血性链球菌16h后几乎均为革兰阴性 对数生长期的细菌，其形态、染色性较为典型，取这时的细菌做革兰染色可反应细菌的真实染色性。 |
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