【原】Nature neuroscience︱不同可卡因成瘾样行为杏仁核中基因调控变化

脑声常谈 2023-10-09 发布于上海

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杏仁核处理正价和负价并有助于成瘾，但所涉及的细胞类型特异性基因调控程序尚不清楚。

基于此，2023年10月5日美国加州加州大学圣地亚哥分校生物研究所整合生物学实验室Francesca Telese 研究团队在Nature neuroscience杂志发表“Single-nucleus genomics in outbred rats with divergent cocaine addiction-like behaviors reveals changes in gene amygdala GABAergic inhibition”揭示了在具有不同可卡因成瘾样行为的远系繁殖大鼠中，单核基因组学显示了杏仁核GABA能抑制基因的变化。

该研究揭示了长期戒断后具有高和低可卡因成瘾行为的远系大鼠杏仁核的单核基因表达和染色质可及性图谱。高成瘾组和低成瘾组之间的不同表达基因在不同细胞类型的能量代谢中富集。高成瘾指数的大鼠在杏仁核中表现出类似复发的行为和GABA能传递的增加。这两种表型都被乙二醛酶1酶的药理抑制所逆转，该酶代谢甲基乙二醛-一种由糖酵解产生的GABAA受体激动剂。高AI和低AI大鼠之间染色质可及性的差异与FOX、SOX和激活蛋白1家族中的先驱转录因子有关。作者观察到在许多细胞类型中染色质可及性的相反调控。兴奋性神经元在高AI大鼠中具有更大的可及性，而抑制性神经元在低AI大鼠中具有更大的可及性。

图一实验设计与大鼠IVSA可卡因成瘾模型

为了研究可卡因对与成瘾样行为相关的细胞状态的影响，作者对HS大鼠停用可卡因IVSA（静脉自身给药）4周后的杏仁核组织进行了snRNA-seq和snATAC-seq实验。这些动物被训练在操作室内通过杠杆按压自我注射可卡因，，测量了每次行为中的可卡因奖励或杠杆按压的数量。与LgA阶段的第一天相比，在LgA阶段期间可卡因奖励的平均数量的增加。在ShA和LgA阶段结束时评估可卡因的动机，使用渐进比率强化计划，其中获得可卡因注射所需的杠杆按压数量逐渐增加。作者将大鼠分为高、低AI（成瘾系数）两组。与LgA阶段相比，两组在ShA中获得的可卡因奖励更少。在ShA期间，两组的可卡因奖励没有差异；高AI的大鼠与低AI的大鼠相比，表现出药物摄入量的逐步增加。在PR过程中，当比较ShA和LgA时，高AI大鼠的可卡因动机增加，而低Al大鼠没有增加。最后，当奖励与脚电击配对时，高AI大鼠接受了更多的可卡因注射，表明强迫性药物使用。这些结果表明，在远系繁殖的大鼠中扩展获得可卡因IVSA的模型捕捉到了可卡因使用障碍的几个相关方面。

图二来自大鼠杏仁核的单核RNA-seq和ATAC-seq

利用已建立的细胞类型特异性标记基因，作者将snRNA-seq簇注释为主要细胞类型，包括兴奋性神经元、抑制性GABA能神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、成熟少突胶质细胞、少突胶质细胞前体细胞和内皮细胞。基于已知细胞标记基因的表达，还鉴定了7种抑制性神经元亚型，并对兴奋神经元进行亚聚，鉴定出18个不同的簇，顶级标记基因包括已知亚群标记Cdh13、Nr4a2和Bdnf。不同样本之间的细胞类型比例似乎是一致的。作者获得的每种细胞类型的细胞核总数有很大差异。对于大多数下游分析，作者主要关注了六种最常见的主要细胞类型。作者生成的snRNA-seq和snATAC-seq数据集是在正常条件下和可卡因成瘾样行为下，大鼠杏仁核中分子定义的细胞类型的第一个单细胞图谱。

图三高、低AI大鼠基因表达的差异

作者检验识别每种细胞类型中高AI和低AI大鼠之间的差异表达基因。Kcnq3在神经元和胶质细胞类型中受到差异调控，并编码钾通道的一个亚基，该亚基与奖赏行为和药物成瘾易感性的调节有关。此外，糖皮质激素受体的两个转录靶点Fkbp5和转录k1在胶质细胞类型中受到不同的调控，并与奖赏行为和药物成瘾易损性相关。为了确定高AI和低AI大鼠之间调控改变的通路，作者进行了基因富集分析。发现了一些与成瘾相关的途径的显著富集，包括神经传递和能量代谢。大多数细胞类型显示出属于氧化磷酸化途径的基因的富集，该基因与葡萄糖代谢一起，是突触活性和动作电位的主要能量来源。以上结果表明，成瘾样行为与杏仁核细胞群代谢状态的改变有关，这可以直接影响杏仁核的神经网络活动。

图四人工智能与伽马氨基丁酸能能的传递有关

为了验证细胞代谢状态的改变影响杏仁核的神经活动的假设，作者关注了伽马氨基丁酸能传递。具体来说，通过记录CeA中的自发抑制性突触后电流来测量GABA能的传递。在戒断4周后，收集5只低AI和5只高AI HS大鼠的队列中CeA切片，作者使用5只年龄匹配的幼稚HS大鼠制备的CeA切片记录了基线GABA能传递，组间平均sIPSC频率存在差异，反映了GABA能传递从低AI到低AI组的逐渐增加，振幅无明显变化。这些结果支持了高人工智能大鼠的可卡因成瘾样行为反映了GABA能传递增加的假说。pBBG是乙二醛酶1的抑制剂，是GABAA受体的竞争性部分激动剂。发现与高AI大鼠相比，pBBG降低了sIPSC频率，没有观察到pBBG对sIPSCs振幅的影响。GLO1抑制可能逆转了长期戒断可卡因IVSA后观察到的行为差异。大鼠在相同的可卡因IVSA操作条件下，但没有药物供应，再次暴露于可卡因注射相关的光线索触发恢复。AI和pBBG处理之间存在显著的交互作用，表明pBBG降低了高AI大鼠中线索诱导的恢复，但在低AI大鼠中没有降低。以上结果表明，通过药理抑制GLO1来调节GABAA的传递，可降低高可卡因AI动物的复发样行为。

图五参与可卡因依赖的调节元件的分析

作者使用了MACS2从snATAC-seq数据中识别可达的染色质区域。为了确定差异染色质可及性是否与差异基因表达一致，重叠每个细胞类型的显著差异可及染色质峰，发现DEGs的启动子，包括抑制神经元、兴奋性神经元和少突胶质细胞中属于氧化磷酸化通路基因的启动子区域。这些发现证实了染色质可及性和基因表达的差异是一致的。总的来说，3.2%的显著差异峰标注为启动子或TSS区域，这是一个实质性的富集的主要细胞类型。这种富集可能表明与成瘾样行为相关的染色质变化更集中在启动子上，或者由于更大的效应大小或更大的染色质可及性。假设高和低AI大鼠染色质可及性的差异是由TF活性的差异引起的。高AI大鼠和低AI大鼠可及性差异最显著的基序簇包含基本螺旋-环-螺旋转录因子的基序。与低AI大鼠相比，高AI大鼠兴奋性神经元的可及性明显更高，抑制性神经元的可及性略有增加。这些聚类中排名最高的基序都包含序列CAGATGG，它与几个神经元先锋TFs的结合位点基序紧密匹配，包括bHLH、RFX和FOX家族。因此，高AI大鼠兴奋性神经元中染色质可及性的广泛增加可能反映了招募染色质重塑的先驱转录因子活性的增加。然而，作者没有观察到属于这些聚类的TFs编码基因表达相应的上调，提示可能有不同的机制影响它们的活性。在高AI大鼠的神经元中，许多可及性增加的基序簇在少突胶质细胞中的可及性降低。在这些主题簇中，最突出的是那些包含FOX和RFX基序。一些基序簇在兴奋性和抑制性神经元之间也有相反的作用，包括SOX、MEF2和Fos基序。AP1和MEF2基序与成瘾及其在长期接触可卡因和其他药物后在大脑中的表达变化有关。与这些结果一致，作者观察到高AI大鼠抑制性神经元较低AI大鼠中编码Fosl1、Fos、Fos、Jun、Junb和Jund的基因表达降低，表明它们表达水平的差异影响了其调节活性。许多基序簇与成瘾样行为跨越数千个调节区域和以细胞类型特异性的方式。评估作者的大鼠snATAC-seq数据与人类成瘾相关特征，在几乎所有细胞类型中，每个性状的单核苷酸多态性遗传力均显著富集，其中神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和OPCs的富集最为显著。以上结果表明，HS大鼠的调节结构与人类成瘾相关特征有关。