二甲双胍新能力-具有成为骨折治疗药物的潜力

继一 2023-10-10 发布于辽宁

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近期，Bone Research杂志发表了题为“Metformin accelerates bone fracture healing by promoting type H vessel formation through inhibition of YAP1/TAZ expression”的文章，指出二甲双胍具有促进骨折愈合的作用，其可能机制为通过抑制YAP1/TAZ的表达促进H型血管形成来加速骨折愈合。这一发现揭示了二甲双胍治疗骨折的潜力。

https://www./articles/s41413-023-00279-4

背景知识

由于各种意外及骨质疏松等原因导致的骨折对患者和社会造成了沉重的负担，尤其是在老龄化加速的环境下，由于年龄等因素导致的骨结构改变（骨质疏松等）进而诱发的骨折开始变得更为常见，对于骨折的治疗也因此显得尤为重要。

二甲双胍常用于治疗胰岛素抵抗相关的疾病，比如Ⅱ型糖尿病、代谢综合征和非酒精性脂肪肝等。有研究认为二甲双胍对于骨组织同样有益，例如有临床研究指出相比其他降糖药，二甲双胍可以降低糖尿病人的骨折风险。此外有体外研究发现二甲双胍对骨母细胞有直接的成骨作用，并能增强骨髓祖细胞的成骨诱导作用。

骨的愈合过程要经历血肿炎症机化期、骨痂形成期和骨痂塑形期3个阶段，骨损伤发生后局部发生无菌性炎症反应，多种细胞释放细胞因子参与骨折修复，骨膜的成骨细胞和软骨组织分别形成骨痂，随后经过钙化、塑形，才能完全恢复骨折前的结构和强度。

在小鼠胫骨中有两种特殊亚型血管，能够调节骨内血管生成和骨形成，维持血管周围骨祖细胞的分化与增殖，使得骨形成与血管生成能协同进行，在骨折愈合过程中发挥重要作用。这两种特殊亚型血管根据其内皮细胞表面抗体表达差异命名，其中CD31、Emcn（endomucin）强阳性被称为H型血管，而CD31、Emcn弱阳性或阴性被命名为L型血管。

研究结果

由于骨折部位通常处于缺氧的局部微环境状态，研究者分别在常氧（21%O₂）和缺氧（1%O₂）条件下探究二甲双胍（Met）对人微血管内皮细胞(HMECs)的影响。结果表明，与常氧条件相比，缺氧使人微血管内皮细胞的迁移能力（图1a&b）、成管能力(图1c-f)、和细胞活性(图1g)下降，而二甲双胍的加入明显恢复了人微血管内皮细胞的这些能力。有研究报导指出缺氧诱导因子1α（HIF-1α）参与血管生成和成骨过程，研究人员接着检测HIF-1α的靶基因Vegfa和Lrg-1的表达，结果发现缺氧条件下这两个基因的表达明显升高，而且二甲双胍处理组的表达相对于对照组更为明显（图1h）。这些结果表明二甲双胍能在缺氧条件下促进人微血管内皮细胞的血管生成。

图1

研究者接着构建骨质疏松性骨折小鼠模型和正常小鼠骨折模型来验证二甲双胍在体内的效果。对于骨质疏松性骨折，取C57BL/6雌鼠进行卵巢摘除手术用于骨质疏松造模，造模成功后再进行闭合性骨折手术和髓内固定手术，接着对照组给予PBS，处理组分别给予二甲双胍（Met）、甲状旁腺激素（PTH）和阿仑膦酸钠(ALN)处理，（PTH和ALN是预防骨质疏松常用的两种药），给药后的3、6、9周分别处死小鼠进行结果分析（实验流程见图2a）。对于正常骨折，取C57BL/6雄鼠进行闭合性骨折手术和髓内固定手术，术后分为对照和处理组，对照组给予PBS，处理组给予二甲双胍处理，分别于给药后2、4、6周处死小鼠进行结果分析（实验流程见图2e）。考虑到骨质疏松小鼠由于年龄等因素会影响骨折愈合过程，为了使结果更有可比性，研究者将第3、6、9周的骨质疏松小鼠结果分别与第2、4、6周的正常小鼠结果进行对比。

小鼠骨折部位的μCT影象表明二甲双胍、甲状旁腺激素和阿仑膦酸钠在三个检测时间点（骨质疏松小鼠的3、6、9周或正常小鼠的2、4、6周）均能显著增加骨折部位的骨痂骨化体积分数（图2b&c，图2f&g），这表明二甲双胍能促进小鼠骨折后骨痂骨化形成。三点弯曲实验表明二甲双胍、甲状旁腺激素和阿仑膦酸钠能显著提升小鼠骨折后再愈合的股骨的最大弯曲受力（图2d&h），表明二甲双胍可以提升小鼠骨折愈合后股骨的力学性能。这些结果表明无论是骨质疏松小鼠骨折还是正常小鼠骨折，二甲双胍均能发挥加速愈合的作用。

图2

为探究H型血管形成是否参与愈合过程，研究者对骨质疏松性骨折小鼠的骨痂进行免疫荧光染色，结果显示二甲双胍处理后CD31和Emcn双阳性细胞（即H型血管内皮细胞）比例显著增加，而且Ki67阳性细胞（增殖的血管内皮细胞）的比例也显著升高，而甲状旁腺激素和阿仑膦酸钠则无此效果（图3a&b）。ELISA检测发现二甲双胍对于血清中的vegfa含量基本无影响，但能显著提升骨髓中vegfa的含量（图3c&d）。这些结果表明二甲双胍能明显促进H型血管形成。

图3

正常骨折小鼠的骨痂免疫荧光结果也展示出相同的趋势（补充图3）。结合前述结果表明二甲双胍在骨质疏松小鼠和正常小鼠中均能促进H型血管形成。

补充图3

有其他文献报导指出HIF-1α在血管生成和成骨过程中发挥关键的调节作用，并且可以与YAP1/TAZ通路共同调节血管生成，因此研究者在人微血管内皮细胞中敲低HIF-1α进一步验证。结果表明，不敲除HIF-1α的情况下，加入二甲双胍处理可以提升HIF-1α及它的靶基因vegfa和Lrg-1的表达（图4b）；敲低HIF-1α后，HIF-1α及它的靶基因vegfa和Lrg-1的表达均下降，敲除HIF-1α后，二甲双胍的作用消失（图4b）。免疫荧光结果显示二甲双胍处理后，YAP1和TAZ的表达下降（图4c&d），HIF-1α表达上升（图4e）；研究者接着对YAP1或TAZ进行敲除（图4f），免疫荧光结果表明，单独敲除YAP1或TAZ并不影响HIF-1α的表达，但YAP1和TAZ均敲除时HIF-1α的表达上升且进一步加入二甲双胍不影响该趋势，这表明二甲双胍可以通过抑制YAP1/TAZ通路来促进HIF-1α的表达。

图4

研究者接着检测了骨质疏松性骨折小鼠的骨痂中HIF-1α、YAP1、TAZ的表达，发现二甲双胍处理可以显著提升HIF-1α的表达（图5a），降低YAP1、TAZ的表达（图5b&c），而其他两种药物（PTH和ALN）则没有这个效果（图5），这表明二甲双胍在骨质疏松小鼠骨折愈合过程中也可以通过抑制YAP1/TAZ来促进HIF-1α的表达。

图5

类似地，正常小鼠的骨痂荧光染色结果也表现出类似结果，二甲双胍处理可以显著提升HIF-1α的表达（补充图4a），降低YAP1、TAZ的表达（补充图4b&c），表明二甲双胍在正常小鼠骨折愈合过程中也是通过抑制YAP1/TAZ通路促进HIF-1α的表达，从而促进骨折愈合。

补充图4

研究者反过来又在骨质疏松小鼠体内过表达YAP1/TAZ验证二甲双胍的促愈合作用是否会被削弱。研究者在骨质疏松小鼠骨折部位局部注射AAV-control和Yap1/Taz-AVV（用于过表达Yap1/Taz），并于6周后取样分析（图6a）。μCT结果和三点弯曲实验结果显示，与单纯二甲双胍处理组对比，给予二甲双胍同时过表达Yap1/Taz的处理组骨痂骨化程度明显降低（图6b&c），骨折愈合后股骨的最大可承受力也显著降低（图6d）。免疫荧光结果显示过表达Yap1/Taz，二甲双胍的促进H型血管形成作用也显著下降，新增殖的血管内皮细胞也显著减少（图6e）。这些结果表明过表达Yap1/Taz会削弱二甲双胍对骨折愈合的促进作用。