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题目：M1‑like macrophage‑derived exosomes suppress angiogenesis and exacerbate cardiac dysfunction in a myocardial infarction microenvironment 发表时间：2020年2月28日 期刊: Basic research in cardiology 影响因子：11.981 作者及单位：广州医科大学第二附属医院刘世明课题组 主要结论：这篇研究中，作者证实了巨噬细胞外泌体在心肌梗死修复中的新作用。发现M1巨噬细胞分泌含miR-155外泌体，并作用于心肌梗死后内皮细胞，通过抑制Sirt1/AMPK-eNOS及RAC1-PAK1/2信号通路，阻碍心肌血管再生，加重梗死后损伤，影响心肌梗死患者生存结局。 关键词：M1样巨噬细胞、外泌体、miR-155、血管生成、心肌梗死微环境 撰稿 | 万淑君 校对 | 朱小龙 审核 | 吕坤、徐阳 心肌梗死（Myocardial infarction, MI）可导致心脏缺血和心肌细胞不可逆性死亡，是世界范围内主要致病和致死原因之一。临床上早期再灌注治疗，恢复心脏血供，是目前心肌梗死患者最主要治疗方式。然而，再灌注治疗在临床实践中存在诸多问题，如缺血-再灌注损伤及易错失灌注最佳时机等。治疗性血管生成在促进心肌梗死修复和预防不良心室重构方面具有显著作用，因此深入研究心肌梗死后新生血管生成影响因素及潜在机制至关重要。 2020年2月28日，广州医科大学第二附属医院刘世明在《Basic research in cardiology》杂志发表题为'M1‑like macrophage‑derived exosomes suppress angiogenesis and exacerbate cardiac dysfunction in a myocardial infarction microenvironment'的研究论文，发现心肌梗死M1巨噬细胞分泌含miR-155外泌体，并作用于梗死后血管内皮细胞，通过靶向RAC1、PAK2、Sirt1、AMPKα2和eNOS，抑制Sirt1/AMPK-eNOS及RAC1-PAK1/2信号通路，阻碍新生血管再生及心脏功能恢复，为靶向M1巨噬细胞miR-155外泌体及相关信号以促进心肌梗死后修复提供了基础。
一、背景介绍 1、心肌梗死 心肌梗死（Myocardial infarction, MI）可导致心脏缺血和心肌细胞不可逆性死亡，是世界范围内主要致病和致死原因之一。治疗性血管生成在促进心肌梗死修复和预防不良心室重构方面具有显著作用，然而其具体影响因素及潜在机制仍不清楚。 2、免疫巨噬细胞与心肌梗死 免疫炎症，特别是巨噬细胞调节，在心肌梗死后的心脏修复和重塑中起着重要的调节作用。单核细胞侵入心肌梗死微环境并逐渐分化为巨噬细胞。巨噬细胞作为主要的免疫细胞参与心肌梗死免疫炎症过程。巨噬细胞在功能和表型上分化为两个典型亚群，即经典激活巨噬细胞（M1）和选择性激活巨噬细胞（M2），它们是在特殊的心脏微环境中诱导产生的。小鼠心肌梗死后，M1巨噬细胞在第一个炎症期的前5天占主导地位（3-4天达到峰值），M2巨噬细胞在第5天之后占据主导地位。M1和M2巨噬细胞表现出不同的功能，可加重或减轻梗死心脏组织的炎症。M1细胞产生高水平的促炎细胞因子[如肿瘤坏死因子-α（TNF-α），白细胞介素-1β（IL-1β）]和蛋白酶，具有吞噬和蛋白溶解的特性，有助于清除细胞碎片。相反，M2巨噬细胞产生抗炎/修复性细胞因子[如白细胞介素-10、血管内皮生长因子（VEGF）]，介导炎症消退及促进损伤组织修复/重塑。 虽然M1巨噬细胞在炎症反应中可以发挥积极作用，但M1巨噬细胞的过度激活可促进心肌细胞死亡，抑制心肌再生和增殖，促进其纤维化，抑制新生血管形成，从而导致心肌梗死区域扩大，甚至心脏破裂。实验研究表明，抑制M1单核/巨噬细胞可以缩短促炎时间，促进心肌梗死后功能性心输出量恢复。由于心肌梗死愈合过程中，抑制巨噬细胞可导致内皮新生血管生成受阻，因此巨噬细胞群体被定义为促血管生成因子，但不同亚型巨噬细胞在血管生成中的不同调节作用仍存在争议。体内外实验均观察到抗炎M2巨噬细胞具有促进血管生成的作用，而促炎M1巨噬细胞具有抗血管生成作用。因此，M1巨噬细胞在血管生成中的有效影响和确切潜在机制需要进一步研究。 3、外泌体 外泌体是细胞来源的直径约30-150nm的纳米囊泡，可存在于组织、体液（包括血液和尿液）和细胞培养基中。外泌体通过转移胞内物质，如miRNA和蛋白等至受体细胞，在细胞间发挥重要的信号转导作用。近期研究发现，梗死心肌细胞可分泌有害外泌体，导致移植骨髓间充质干细胞损伤。单核/巨噬细胞是外泌体重要来源，巨噬细胞外泌体具有强大的免疫或炎症调节功能。近年来，M1巨噬细胞来源外泌体的作用逐渐被阐明。例如，脂多糖（LPS）/干扰素-γ（IFN-γ）或高血压条件诱导人单核细胞外泌体生成，促进核因子-kappa B激活及胞间细胞粘附分子-1（ICAM-1）、趋化因子配体2和白细胞介素-6（IL-6）表达，促使内皮细胞（ECs）功能障碍。脂肪组织来源M1样巨噬细胞所释放的外泌体包含丰富的miRNA，如miR-155和miR-146a，可导致小鼠胰岛素抵抗。人巨噬细胞来源外泌体通过调控整合素转运，抑制EC迁移，从而参与心脏修复/重构，包括抑制心脏成纤维细胞（CF）增殖和促进MI后炎症反应。 本研究中，研究者假设M1样巨噬细胞来源外泌体将特异性miRNA转运至心肌梗死后EC中，影响血管生成和修复，并对其潜在机制进行研究。 二、结果解析 1．MI微环境中M1巨噬细胞分泌外泌体 MI第3天，通过连续、差速和超速离心，从小鼠心肌梗死模型心脏组织中分离收集外泌体。通过透射电镜（TEM）直接观察分离微球的形态特征，发现微球为直径约100 nm的杯状膜结合囊泡（图1a）。随后，我们进行纳米颗粒追踪分析（NTA）测量囊泡的大小分布,发现几乎所有颗粒直径都在30~150 nm之间，平均104±11 nm（图1b）。此外，与免疫印迹分析的组织裂解物相比，囊泡制备物高度富集了外泌体标记蛋白Alix、CD63和CD81，而不是内质网标记物Calnexin（图1c）。因此，我们得出MI心肌组织释放的孤立囊泡是外泌体。 研究发现，心肌梗死后第3天，心肌组织或循环血液外泌体数量显著增加（图1d）。免疫组化检测梗死心肌，发现CD63表达水平明显高于对照手术组。以上结果表明心肌梗死后，外泌体在心肌组织间积聚（图1e）。Rab27a与酸性鞘磷脂酶（aSMase）是细胞外囊泡发生的重要条件。通过对Rab27a - / -和aSMase - / -小鼠进行研究发现，与野生型小鼠（WT）相比，Rab27a或aSMase缺失可降低MI心肌组织中外泌体分泌（图1f）。 免疫炎症在心肌梗死后心脏修复中发挥重要作用。由于M1巨噬细胞在心肌梗死后第3天活性达到峰值，占绝对主导地位。我们假设第3天M1巨噬细胞外泌体对心脏修复/重构产生影响。在分离梗死心肌外泌体中，我们发现M1巨噬细胞标记蛋白，包括CD86、CD11c和诱导型一氧化氮合酶（iNOS），在第3天达到峰值（图1g），并且与外泌体标记分子CD9和CD63动态变化相一致（图1g）。 组织微环境中的信号决定巨噬细胞极化方向。心肌梗死组织中充满早期M1巨噬细胞前体、缺血和缺氧应激分子、大量趋化因子和促炎细胞因子，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IFN-γ、TNF-α和IL-1β。这些因素都能在一定程度促使巨噬细胞向M1发生极化。研究中，我们发现IFN-γ GM-CSF、IFN-γ、TNF-α、IL-1β、OGD或H2O2诱导人THP-1和小鼠RAW246.7巨噬细胞M1极化，可释放较多外泌体（M1-Exos）。最终，我们选择IFN-γ GM-CSF模拟体内MI环境，诱导巨噬细胞M1极化。此外，我们发现，通过GM-CSF/IFN-γ诱导腹腔巨噬细胞和骨髓来源巨噬细胞M1极化，较M0巨噬细胞释放更多的外泌体（图1i）。
2. M1-Exos抑制心脏血管生成，加重心肌梗死损伤 研究者假设M1-Exos在心肌梗死后心脏修复中发挥重要作用。为了验证这一假设，研究者将小鼠RAW246.7巨噬细胞M0-Exos或M1-Exos注射至心肌梗死模型心肌组织中，结果发现，M1-Exos处理小鼠存活率低于M0-Exos处理组及MI不处理组。心肌梗死后28天，M0-Exos处理组与单纯MI组相比，心功能无明显变化。与M0-Exos处理组及单纯MI组相比，M1-Exos处理组心脏喷射分数（EF）和缩短分数（FS）值显著降低，致使左心室收缩力和心功能抑制（图2b）。 三苯四氮唑（TTC）染色结果表明，M1-Exos可使心肌梗死面积扩大（图2c）。心肌梗死后血管生成增强，以促进正常心脏修复。然而，心肌梗死第14天和第28天免疫组化分析结果显示，相比于M0-Exos处理组和单纯MI组，M1-Exos处理组抑制了α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和CD31的表达（图2d）。此外，M1-Exos可抑制心脏VEGFA-VEGF受体2（VEGFR2）信号通路（图2e）。以上结果表明，M1-Exos抑制血管生，阻碍心肌梗死后心脏修复，从而加重心脏损伤。
3. M1-Exos阻碍内皮细胞血管生成能力 为检测M1-Exos对内皮细胞（ECs）的作用，研究者将人THP -1衍生的M1-Exos与人冠状动脉内皮细胞（HCAECs）共培养。结果显示，PHK -26标记M1-Exos可被ECs吸收（图3a）。与M0-Exos相比，M1-Exos下调Akt和内皮一氧化氮合成酶（eNOS）磷酸化水平（图3b），Akt - eNOS信号通路受抑制。此外，M1-Exos 可使EC损伤，促进可溶性ICAM-1（sICAM-1）和可溶性血管细胞粘附分子-1 （sVCMA-1）分泌（图3c）。 CCK-8和EdU实验表明M1-Exos可抑制ECs活力（图3d），并使增殖能力下降（图3e）。Transwell（图3f）或划痕/伤口迁移实验（图3g）显示，与M0-Exos或PBS对照组相比，M1-Exos可使ECs向小室或伤口迁移能力减弱。此外，研究发现M1-Exos可抑制ECs血管生成能力（图3h）。
4. M1-Exos将miR-155转移至ECs 外泌体通过转运miRNA和蛋白质等，调控受体细胞各种信号通路。miR-155作为M1巨噬细胞分化的特殊标志物，在M1-Exos中高表达。研究发现，心肌梗死后第3天，心脏中的miR-155水平上调（图4a），心肌组织外泌体miR-155含量增加（图4a）。此外，在GM-CSF IFN-γ、TNF-α、IL-1β或OGD刺激下，人THP-1及小鼠RAW246.7巨噬细胞miR-155和外泌体miR-155水平显著升高（图4b）。上述结果在小鼠PM或BMDM M1巨噬细胞中同样被证实（图4c）。我们将Cy3-miR-155 mimic转染THP-1 M1巨噬细胞，并从培养基中分离外泌体，将其与HCAECs共培养。ECs出现的红色荧光表明，M1样巨噬细胞外泌体miR-155可转运至目标ECs中（图4d）。与M0-Exos或PBS对照相比，M1-Exos处理组ECs中的miR-155水平显著上升（图4e）。此外，Triton X-100与RNase可破坏外泌体膜，并消化RNA，使上述结果消失（图4e）。因此，ECs中miR-155高表达来源于M1-Exos。
5. MiR-155抑制血管生成 MiR-155是重要的炎症调节因子之一。本研究发现hsa-miR-155 mimic可抑制Akt-eNOS信号通路，anti-miR-155则作用相反（图5a）。此外，miR-155 mimic可促进sICAM-1和sVCMA-1分泌（图5b），而anti-miR-155反作用甚微。以上结果表明，miR-155对ECs有抑制作用。研究还发现，miR-155 mimic可抑制ECs活力、增殖、迁移和血管腔形成（图5c-f）。心肌内注射慢病毒-mmu-miR-155-5p（LV-miR-155）或慢病毒- anti-mmu-miR-155-5p（LV-anti-miR-155）可使α-SMA和CD31的表达水平降低或升高（图5g）。此外，LV-miR-155或LV-anti-miR-155 促使MI后的VEGFA-VEGFR2水平降低或增加（图5h）。以上结果表明，miR-155可抑制血管生成。
6. MiR-155加重心肌梗死后心脏损伤 为了评估miR-155对心脏功能的影响，我们向心肌内注射LV-miR-155，结果发现小鼠心肌梗死模型存活率显著下降（图6a），左心室射血分数（EF）和左心室缩短分数（FS）值降低（图6b），并梗死面积增大（图6c）。相反，LV-anti-miR-155可改善心功能，减少心肌损伤（图6）。
7. Rac家族小GTPase 1（RAC1）、p21（RAC1）活化激酶2（PAK2）、Sirtuin 1（Sirt1）和蛋白激酶AMP活化催化亚基α2（AMPKα2）是miR-155新的靶基因 研究者随后进行mRNA测序，并结合生物信息学筛选EC中miR-155靶基因。在预测靶标中，研究者注意到RAC1、PAK2、Sirt1和AMPKα2可能是miR-155新的候选基因（图7a）。RAC1 3 '-UTR具有miR-155结合位点，与测序结果相一致（图7a）。此外，荧光素酶活性实验发现，miR-155模拟物可靶向RAC1、PAK2、Sirt1和AMPKα2（图7a, b）。研究者进一步将NC或miR-155 mimic转染到HCAECs中，发现RAC1、PAK2、Sirt1、AMPKα2和eNOS的mRNA表达水平降低（图7c）。免疫印迹实验结果显示，miR-155过表达降低了RAC1、PAK2、Sirt1、AMPKα2和eNOS蛋白水平，而anti-miR-155结果相反（图7d）。有研究表明，以上靶基因参与RAC1-PAK2和Sirt1/ AMPKα2-eNOS信号通路。因此，研究者检测miR-155是否抑制以上两条信号通路。结果表明，miR-155 mimic抑制其磷酸化水平（p-PAK1/2、p-AMPK和p-eNOS）和下游酶活性（p-LIMK1/2和p-ACC），而anti-miR-155促进其活性（图7 d）。此外，有研究表明，Sirt1/AMPK-eNOS及RAC1-PAK1/2信号通路是维持内皮功能和介导血管生成的重要途径。因此， miR-155可能通过靶向RAC1、PAK2、Sirt1、AMPKα2和eNOS抑制以上两种信号通路，导致EC功能和血管生成能力受损。
8. 抗miR-155可部分缓解M1-Exos对血管的损伤 研究者发现LV-anti-miR-155（lentivirus-anti-hsa-miR-155-5p）可提高被M1-Exos抑制的RAC1、PAK2、Sirt1、AMPKα2和eNOS的蛋白水平（图8a）。因此，LV-anti-miR-155可减弱M1-Exos对EC细胞活力（图8b）、增殖（图8c）、迁移（图8d）和管形成的抑制作用（图8e）。
三、亮点总结 本研究展示了巨噬细胞外泌体在心肌梗死后修复中的新作用。心肌梗死后M1巨噬细胞分泌含miR-155外泌体，通过作用梗死后血管内皮细胞，抑制新生血管生成，加重心脏损伤。此外，内皮细胞miR-155通过靶向RAC1、PAK2、Sirt1、AMPKα2和eNOS，抑制Sirt1/AMPK-eNOS及RAC1-PAK1/2信号通路，阻碍新生血管再生及心脏功能恢复。本研究为巨噬细胞在心肌梗死中的作用机制提供了新视角，并为靶向M1巨噬细胞miR-155外泌体及相关信号以促进心肌梗死后修复提供了理论基础。
原文链接：https:///10.1007/s00395-020-0781-7 转载须知 |
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