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单一测定中鉴定和表征所有主要的人类免疫细胞系。这种经过验证且易于获得的工作流程确保了全面的免疫表型分析，提高了数据的可比性，并允许识别与疾病相关的免疫特征和人类免疫疗法的生物标志物。
 01 免疫表型方案 为了建立一个用于单程分析的全面的人类免疫表型方案，采用了一种细胞谱系不可知的方法，以最大限度地覆盖免疫疗法试验中生物样本（即外周血和组织）中预期的所有免疫群体。这将是在人类癌症样本中检测的理想选择。该列表包括T细胞、B细胞、自然杀伤（NK）细胞以及各种髓细胞和粒细胞群体，因此涵盖了通常发现的所有主要免疫细胞谱系（图1A）。  图1. 癌症免疫治疗临床研究中免疫成分的综合评价。（A） 肿瘤患者的常见样本类型包括外周血样本和肿瘤活检。在这些样本中，显示了免疫细胞谱系和各自的亚群。除了群体识别外，重要的临床靶点和目前可用的生物标志物也有包括。（B） 标记物是根据群体和亚群鉴定或定义重要激活和/或成熟阶段的相关性来选择的。 考虑到质谱流式的高维能力，所提出的多色方案并没有耗尽实验中常用的全部金属同位素，还允许再包含10个或更多额外的抗体，以进一步定制多色方案，使其适应更具体的假设。 02 代表数据 多色方案能够识别多种免疫细胞亚群。例如，T细胞可以进一步细分为CD4+Th、CD8+T细胞、NKT和γδT细胞（图2A和2C）。此外，使用CD27、CD45RA、CD45RO和CCR7的差异表达模式，可以区分T细胞的几种成熟和抗原体验状态，如幼稚、效应、效应记忆和中枢记忆（图2C）。通过CD25的高表达、CD127的低至阴性水平以及谱系定义转录因子FoxP3的表达来鉴定Treg细胞。 除了T细胞，其他免疫细胞谱系可以细分为各种功能亚群（图2C）。通过CD27和CD38的表达区分B细胞成熟的不同阶段，基于CD14和CD16的表达区分多个功能不同的单核细胞亚群，基于CD16和CD56的组合表达区分NK细胞亚群。 除了免疫细胞组成外，还可以使用该多色方案评估其他几种细胞特征（图2D）。CD25、HLA-DR和CD38允许测定T细胞的活化状态，而Ki-67的表达鉴定了多种类型的活跃增殖细胞。重要的是，免疫检查点相关分子PD-1、PD-L1、CTLA-4和TIM-3的表达水平可以在所有细胞上进行评估。总之，本文提出的高度优化的免疫监测方法能够同时全面评估免疫成分和细胞激活状态。   图2. 外周血免疫细胞亚群的数据挖掘与鉴定。（A） 细胞被预门控为non-beads, DNA+, single, live, CD45+, CD235ab/CD61−, non-neutrophils。主要免疫谱系和某些亚群是通过指示的一系列门控步骤来识别的。（B） 健康供体PBMC的中位频率±SEM（n=5）。（C） 免疫细胞亚群的示例性鉴定，在所指示的群体上预先门控。Treg细胞可被鉴定为CD25high CD127low, FoxP3pos或其组合。（D） 评估各种免疫细胞群上重要检查点和激活分子的表达水平。 03 可靠性和稳健性 经验证，该多色方案在不同实验室，不同仪器上，可获得高度一致的结果；固定和未固定样本之间的总体高度相似的免疫谱。此方案具有高度稳健性和可重复性，以及与传统流式的强相关性。  图3. 独立分析中免疫成分的可重复性评估。在两个研究中心对来自健康供体（n=5）的PBMC进行了分析。通过连续门控来识别免疫细胞群（见图2）。 04 高维数据分析方法 各种自动化数据分析方法可以应用于本文提供的多色组合方案生成的高维数据集，从而允许对单个样本或样本组进行探索、可视化和比较，最终以无假设和全面的方法获得新的生物学见解。  图4. 自动化数据可视化和群体识别。使用多色组合方案通过质谱流式分析来自健康受试者（n=5）的PBMC和来自癌症患者（n=5）的肿瘤活检组织样本。 05 疾病相关免疫特征 综合免疫表型分析呈现骨髓移植后白血病患者的造血重建情况并识别潜在的GvHD相关免疫特征。  图5. 骨髓移植后疾病相关免疫特征的鉴定。 分析了主要免疫谱系的30个免疫细胞亚群（图5B），免疫重建以T细胞（29.0%±7.5%）和单核细胞（27.0%±5.4%）为主，其次是NK细胞（7.1%±0.9%）和HLA-DR-CD16+细胞（图5E）。B细胞（以CD27-B细胞为主）的出现频率较低（2.5%±1.3%）。 该队列中GvHD植入失败/发生的潜在免疫特征（图5F）分析：首先，GvHD患者的CD27-B细胞减少（0.44%±0.21%对3.33%±2.2%，p=0.0046，FDR=0.069；图5G）。此外，GvHD患者的原始CD4+T细胞频率较低（0.09%±0.03%对0.3%±0.3%，p=0.0036，FDR=0.069）。 总之，这证明了此多色方案在医疗环境中对免疫扰动进行临床相关监测的实用性。采用这种方法，可以直接而全面地评估治疗、疾病或依赖时间的免疫反应，以发现新的生物标志物和免疫特征。 06 可扩展性和灵活性 在不进行修改的情况下，将多达10种或更多的抗体添加到所述多色方案中。举例展示了在两个不同场景中的重组能力，重点关注不同的白细胞群体。  图S4. 加入了另外10种抗体，以进一步区分B细胞成熟以及共刺激分子和同种型表达，鉴定多个额外的B细胞亚群，包括浆细胞和几个阶段的同种型转换的初始和记忆B细胞。  图6. 通过包括针对与树突状细胞（DC）、中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞相关的分子的抗体及其激活或共刺激状态，将重点放在组织固有的髓细胞亚群上。该分析，纳入了鳞状细胞癌患者的肿瘤活检（n=4）和匹配的转移性淋巴结样本（n=2）分析。 这种组合方案扩展能够比较从原发性肿瘤和淋巴结转移中分离的细胞。肿瘤和淋巴结之间定义的亚群的频率具有可比性（图6E、S4D和S4E）。进一步比较了共刺激分子在来自淋巴结和肿瘤的髓系人群中的表达，并观察到与各自的原发肿瘤相比，从淋巴结转移中分离的所有三个MDC亚群中CD86表达均有增加的趋势（图6F和6G）。总之，这些结果表明，在保持覆盖各种组织和采集条件下的所有免疫群体的能力的同时（图1-5），所提出的免疫多色方案和工作流程提供了灵活性，以进一步提高对特定免疫群体或科学假设的分析分辨率。 总之，本文建立并广泛验证了一个全面免疫表型的实验框架。尽管该33+10色方案最初的范围是应用于癌症免疫疗法领域的临床研究，但其对免疫细胞状态和群体的广泛评估将是其他领域研究的有价值方法，如传染病、疫苗开发、以及自身免疫的评估。这项研究证明了该平台的广泛适用性，并举例说明了它将如何加速和改善临床试验患者的免疫监测。总之，通过采用细胞不可知论方法进行免疫监测，制定统一的多色方案和工作流程进行全面分析，有利于治疗机制的阐明和免疫细胞特征和生物标志物的发现。 Reference Comprehensive Immune Monitoring of Clinical Trials to Advance Human Immunotherapy doi: 10.1016/j.celrep.2019.06.049 FCMinfo |
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