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题目：GmPLP1 negatively regulates soybean resistance to high light stress by modulating photosynthetic capacity and reactive oxygen species accumulation in a blue light-dependent manner 刊名：Plant Biotechnology Journal 作者：Xue Zhao, Yongguang Li et al. 单位：Northeast Agricultural University, Harbin 日期：18 August 2023    01 摘要  高光胁迫是限制作物产量的重要因素。光受体在对高光应激的反应中发挥着重要作用，但其机制仍不清楚。在这里，我们发现GmPLP1（一种阳性蓝光受体蛋白）的丰度受到高光胁迫的显著抑制，并且主要对高蓝光作出反应。GmPLP1 RNA干扰大豆品系在高光胁迫下表现出较高的光能利用能力，较少的光损伤和活性氧（ROS）在叶片中的积累，而GmPLP1:GmPLP1-Flag过表达大豆的表型表现出相反的特征。然后，我们确定了GmPLP1和GmVTC2之间的蛋白质-蛋白质相互作用，这种相互作用的强度主要受蓝光强度的影响。更重要的是，GmVTC2b的过表达通过增加抗坏血酸的生物合成来增强ROS清除能力，从而提高了大豆对高光胁迫的耐受性。在GmVTC2b-ox大豆叶片中干扰GmPLP1干扰片段后，这种调节显著增强，但当GmPLP1瞬时过表达时，这种调节减弱。这些发现表明，GmPLP1通过感知蓝光来调节大豆的光合能力和ROS积累，以适应光强的变化。综上所述，本研究发现了GmPLP1参与大豆高光胁迫的新机制，对提高大豆产量和大豆对高光的适应性具有重要意义。 02 技术路线  The soybean variety 'DongNong 50’ (DN50) was used as the WT and the background plant for genetic transformation. Plasmid construction and transformation of soybean Immunoblot analysis Measurements of chlorophyll fluorescence Pull-down assay、Y2H assay、BiFC assay Luciferase complementation assay、GDP-L-galactose phosphorylase assays Injection of soybean leaves、Transcriptomic analysis 03 主要结果 3.1 GmPLP1蛋白表达模式的分析 为了验证GmPLP1是否与其他光感受器具有相同的功能，本研究首先分析了GmPLPl基因在高光胁迫下的表达模式。与低白光（LWL）相比，高白光（HWL）下GmPLP1的mRNA表达丰度显著降低，在8 h（图1A）。 然后，本工作通过构建GmPLP1自启动子的过表达大豆模型（GmPLP1:GmPLP1-Flag），进一步探索了蛋白质水平上的表达模式。我们鉴定了三个独立的T3纯合过表达（GmPLP1-ox）转基因系，如RT-qPCR和免疫印迹分析所证实的。 过去的研究发现，蓝光受体以光强度依赖和质量依赖的方式精细调节植物的许多生理反应。本工作分析了GmPLP1蛋白在不同蓝光和红光强度下的表达。GmPLP1蛋白的表达丰度在低蓝光（LBL）下显著增加，但在高蓝光（HBL）下明显降低（图1C）。GmPLP1蛋白的表达丰度未被低红光（LRL）诱导，而在高红光（HRL）下显著降低，但不如在HBL下显著降低（图1C）。以上结果表明，GmPLP1可能参与对高光应力的反应，并主要对HBL反应。
3.2 GmPLP1通过调节大豆的光合能力和ROS积累参与对高光胁迫的反应 为了验证我们的假设，还对转基因大豆幼苗进行了表型观察。GmPLP1-i大豆通过PCR、RT-qPCR和条形测试条鉴定。先前的研究发现，高光胁迫会导致光抑制，进而影响植物叶片利用光能的能力。 本研究首次测量了WT、GmPLP1-ox和GmPLP1-i转基因大豆植株在0–2000下的光响应曲线。结果表明，当光强达到弱光区（0-500 μ mol/m2/s）时，各植物的净光合速率（Pn）没有显著差异。Pn随着光照强度的增加而持续增加，GmPLP1-i植物的Pn和光饱和点显著高于野生型植物，而过表达植物的Pn和光饱和度显著降低（图2A），表明GmPLP-1i植物具有更高的光能利用率。当植物叶片吸收的光能超过其需求时，多余的光能将导致PS II的光化学效率降低（用最大荧光Fv/Fm表示）并产生ROS。因此，本工作进一步测量了WT、GmPLP1-ox和GmPLP1-i植物中的Fv/Fm和ROS含量。与野生型相比，GmPLP1-ox植物叶片中的Fv/Fm值显著降低，表现出明显的光损伤，而GmPLP-1i的叶片在高光胁迫下0.5 h.与WT相比，GmPLP1-ox植物的大多数叶片遭受严重的光照损伤，而GmPLP-1i植物在6 h（图2B，C）。此外，3，3′-二氨基联苯胺（DAB）染色、硝基蓝四氮唑（NBT）染色和H2O2检测在高光胁迫下的WT、GmPLP1-ox和GmPLP1-i植物中显示，GmPLP1-ox大豆中的ROS含量显著高于野生型，而GmPLP-1i植物中的活性氧含量显著低于野生型（图2D，E）。 此外，先前的研究表明，较高的光合作用速率可以提高作物生物量和产量（Long等人，2006年）。使用盆栽实验在自然光下观察WT、GmPLP1-ox和GmPLP1-i转基因大豆植物的生长。与野生型植物相比，GmPLP1-i植物通常生长得更好，叶面积最大，而GmPLP1-ox植物的生长较弱（图2F，G）。还确定了植物成熟后与产量相关的性状（图2H），发现GmPLP1-i的百粒重和单产显著高于WT（图2L，M）。尽管GmPLP1-ox植物的分枝、荚和种子数量与WT相比没有显著差异，但GmPLP1-i植物的分枝和荚和种子的数量显著增加（图2I–K）。上述结果表明，GmPLP1通过调节大豆的光合能力和ROS积累参与了对高光胁迫的反应。
图2: GmPLP1负调控大豆对高光胁迫的反应。 （A） 野生型（WT）、GmPLP1-ox和GmPLP1-i植物的光响应曲线。CO2浓度为400 μmol。 （B） 对于体内成像，将WT、GmPLP1-ox和GmPLP1-i转基因大豆的幼苗暴露在强光下（1800 μmol/m2/s），在0、0.5、1、2和6h时检测到PSII光化学的最大效率（Fv/Fm比） （C）数据是在0或6h时收集的将三周大的WT大豆幼苗置于黑暗中以平衡2 天，然后转移到LWL（50 μmol/m2/s）和HWL（1800 μmol/m2/s）。 （D） （a）来自WT、GmPLP1-ox和GmPLP1-i幼苗的大豆叶片在强光下6 h.时的DAB和（b）NBT染色 （E）在0或6h的强光下测量WT、GmPLP1-ox和GmPLP1-i的叶片中的H2O2含量 （F）在自然光下生长的WT、GmPLP1-ox和GmPLP1-i植物的形态。 （G） WT、GmPLP1-ox和GmPLP1-i植物的叶面积。（H） WT、GmPLP1-ox和GmPLP1-i植物的成熟表型。（I） 分支编号。（J） 每株植物的种子数。（K） 每株植物的荚数。（L） 100种子重量。（M） 单株产量。 3.3 GmPLP1通过LOV结构域与GmVTC2b物理相互作用，这种相互作用在蓝光下减弱 此外，我们使用酵母双杂交（Y2H）系统来筛选GmPLP1的潜在相互作用因子。Y2H结果显示，GmPLP1与酵母细胞中的所有三种GmVTC2（GmVTC2a、GmVTC2b和GmVTC2）家族蛋白相互作用（图3a）。我们还通过进行体外下拉测定证实了GmPLP1与GmVTC2的相互作用（图3b）。本研究通过双分子荧光互补分析（BiFC）（图3c）和萤光素酶互补分析（LCA）（图3d）进一步证实了GmPLP1和GmVTC2在体内的相互作用。 然后，我们分析并鉴定了GmPLP1和GmVTC2b相互作用的关键结构域。在Y2H测定中使用截短的GmPLP1片段（GmPLP1PAS和GmPLP1-LOV）和GmVTC2b片段（GmVTC2b-1、GmVTc2 b-2和GmVTC2b-3）。结果表明，GmPLP1-LOV（190–391 aa）区域足以使GmPLP1与GmVTC2结合（图3e）。然而，GmVTC2b-1、2、3和GmPLP1之间没有相互作用，这表明GGP蛋白作为一个完整的结构域发挥作用（图3f）。
图3 GmPLP1通过LOV结构域与GmVTC2b物理相互作用。 （a） GmPLP1-GmVTC2相互作用的酵母双杂交（Y2H）分析。AD-T和BD-53作为阳性对照。 （b） GmPLP1和GmVTC2b相互作用的体外GST下拉测定。 （c） 证实了GmPLP1与GmVTC2b的体内相互作用。 （d） 证实了GmPLP1与GmVTC2b的体内相互作用。 （e） Y2H测定表明GmVTC2与GmPLP1蛋白的GmPLP1-PAS和GmPLP1-LOV区域相互作用。 （f） Y2H测定表明GmPLP1与GmVTC2b蛋白的GmVTC2b-1、GmVTc2 b-2和GmVTC2 b-3区域相互作用。 先前的研究表明，蓝光受体及其相互作用因子之间的相互作用强度受到蓝光的影响。为了验证GmPLP1和GmVTC2b之间的相互作用是否也受到不同蓝光和红光强度的影响，我们使用LCA分析了本氏烟中的相互作用强度。如图4a所示，与黑暗相比，GmPLP1-GmVTC2b相互作用在蓝光下显著减弱，并且相互作用强度随着蓝光强度的增加而降低。然而，不同强度的红光对GmPLP1和GmVTC2b之间的相互作用的影响可以忽略不计（图4a）。通过进行Y2H测定获得了类似的结果（图4b）。 如果LOV结构域负责感应蓝光减少的GmVTC2b结合，我们推测光化学LOV突变Cys285 → Ala（C285A）和Arg286 → Asp（R286D）应影响相互作用的强度。基于蛋白质序列比对，发现Cys和Arg在AtFKF1 LOV、GmFKF1 LOV、AtZTL LOV、GmZTL LOV、SlPLP1 LOV和GmPLP1 LOV结构域中是保守的。这些LOV突变增强了蓝光下的相互作用（图4c）。C290A突变完全消除了蓝光抑制的相互作用，显示出与黑暗下相同的结果。通过进行Y2H测定获得了类似的结果（图4d）。这些结果表明，蓝光抑制GmPLP1和GmVTC2b之间的结合需要光激活的LOV结构域，而C285A突变消除了该结构域。
图4 蓝光减弱了GmPLP1和GmVTC2b之间的相互作用。 （a） GmPLP1和GmVTC2b在不同蓝光和红光强度下的相互作用。 （a，c）收集叶片0和6 h暴露于不同的光照条件下进行LUC成像和荧光素酶活性测量。 （b） GmPLP1和GmVTC2b在酵母细胞中不同蓝光和红光强度下的相互作用。 （c） 在黑暗、蓝色（500 μmol/m2/s）和红光（600 μmol/m2/s）。GmPLP1（C285A）-nLUC、GmPLP1R286D-nLUC和GmVTC2b-cLUC在N的叶片中共表达。 （d） 黑暗、蓝色（500 μmol/m2/s）和红光（600 μmol/m2/s）。 3.4 GmVTC2b通过减少ROS积累提高大豆对高光胁迫的耐受性 先前的研究发现，VTC2通过调节拟南芥中的AsA生物合成来响应高光胁迫。为了验证GmVTC2b是否参与对高光胁迫的反应，实现了proGmVTC2b:GmVTC2 b-FlagFlag（GmVTc2 b-ox）大豆的过表达，并通过RT-qPCR和免疫印迹分析进行了证实。免疫学分析表明，在黑暗和LWL条件下，蛋白质表达丰度较低。在HWL条件下，蛋白质表达呈现持续积累的趋势。在HWL下，GmVTC2b蛋白的表达被显著诱导（图5A）。 本研究进一步区分了GmVTC2b蛋白在不同蓝光和红光强度下的表达模式。免疫测定显示，LBL和LRL不诱导GmVTC2b蛋白的表达丰度，而在HBL和HRL下其表达丰度显著增加。以上结果表明，GmVTC2b可能参与了对高光应力的反应，并且它对HRL和HBL都有反应。然后，本工作测量了在LWL和HWL下GmVTC2b-ox和WT的总AsA含量。结果表明，在LWL条件下，GmVTC2b-ox转基因大豆中总AsA的含量与WT中的含量没有显著差异，但在HWL条件下差异更显著（图5B）。 此外，我们观察了转基因GmVTC2b-ox和野生型大豆在高光胁迫下的表型。叶绿素荧光成像分析表明，在6 h、 而GmVTC2b-ox的叶片保持相对完整。GmVTC2b-ox转基因大豆叶片的Fv/Fm值显著高于WT（图5C，D）。然后，我们在0和6h的高光胁迫下对GmVTC2b-ox和WT的叶片进行了DAB和NBT染色以及H2O2含量的测定 ，结果显示，GmVTC2b-ox积累的ROS较少（图5E，F）。这些结果证实，GmVTC2b通过提高大豆的AsA含量，然后提高其对氧的清除能力，增强了对高光胁迫的耐受性。 为了确认GmPLP1是否影响GmVTC2b的功能，使用大豆叶片的表达系统进行进一步分析，通过GUS染色证实该方法适用于“DN50”大豆叶片（图S7A）。RT-qPCR和免疫印迹分析证实，pCAMBIA300-GmPLP1-GFP（GmPLP1-ox）和pFGC5941-GmPLP1（RNAi）在GmVTC2b-ox转基因大豆中表达。GmVTC2b-ox转基因大豆叶片中对GmPLP1的干扰显著增加了植物对高光胁迫的抗性，叶片中的AsA含量也显著增加，而GmPLP1过表达的大豆叶片表现出相反的表型（图5G）。以上结果表明，GmPLP1可能负调控GmVTC2b的功能，进一步影响AsA的生物合成，并参与对高光胁迫的反应。
图5 GmVTC2b提高了大豆对高光胁迫的耐受性。 （A） GmVTC2b蛋白在黑暗下的表达模式分析，LWL（50 μmol/m2/s）和HWL（1800 μmol/m2/s）。 （B） 响应LBL的GmVTC2b蛋白的表达分析（5 μmol/m2/s），LRL（5 μmol/m2/s），HBL（500 μmol/m2/s）和HRL（600 μmol/m2/s）。 （C） 在LD（16 h光/8 h黑暗）分别与LWL和HWL（D，E） （C）在高光胁迫（1800 μmol/m2/s）用于0、0.5、1、2和6 h体内成像， （F）（a）DAB和（b）6h后GmVTC2b-ox和WT大豆叶片的NBT染色的高光应力。 （G） 6h后，测定了GmVTC2b-ox和WT大豆叶片中H2O2的含量的高光应力。 （H） 表型观察和总AsA含量表明，GmPLP1在高光胁迫下抑制了GmVTC2b的功能。 3.5 GmPLP1通过抑制GGP酶活性负调控AsA生物合成 为了验证我们的推测，首先在LWL和HWL下测量WT、GmPLP1-ox和GmPLPl-i转基因幼苗中的总AsA含量。结果表明，在LWL下，GmPLP1的过表达对内源性总AsA含量几乎没有影响（图6A），但在HWL下，与WT相比，总AsA的含量显著降低（图6A）。与WT相比，GmPLP1-i植物在LWL和HWL条件下都增加了总AsA的含量（图6A）。这表明GmPLP1响应于不同的光强度而负调控AsA的合成。然后，我们在WT和GmPLP1-i大豆的叶片中过表达GmVTC2b基因，并使用上述方法进一步验证了GmPLP1和GmVTC2b之间的关系。 免疫印迹分析显示，pCAMBIA3300-GmVTC2b-GFP（GmVTC2b-ox）在WT和GmPLP1-i转基因大豆中表达。与EV相比，研究发现，在WT和GmPLP1-i大豆中，GmVTC2b过表达的叶片对高光胁迫的抗性显著增加，但GmVTC2b叶片中AsA含量与GmPLP-1i中EV的比率显著高于WT（图6B）。最后，在HWL条件下分析了野生型、转基因GmPLP1-ox和转基因GmPPLP1-i大豆的GGP酶活性。与野生型相比，GmPLP1-ox转基因大豆中的GGP酶活性显著抑制，GmPLP1-i活性显著增加（图6C）。这些结果证实，GmPLP1通过抑制GGP的活性来抑制AsA的生物合成，然后导致大豆高耐光性的负调控。此外，我们还分析了GmVTC2b在LWL和HWL下的WT、GmPLP1-ox和GmPLP1-i转基因植物中的表达水平。与WT相比，LWL下GmVTC2b的表达没有显著差异，而HWL下GmPLP1-ox中GmVTC2b的表达显著增加，GmPLPl-i中GmVTC2b的表现显著降低（图S8）。我们假设这可能与AsA的反馈调节有关。 有趣的是，转录组用于分析GmPLP1是否也通过在强光下调节WT、GmPLP1-ox和GmPLP1-i大豆中的一些下游高光反应基因而参与对高光胁迫的抗性。Venn图显示，与WT相比，GmPLP1-ox和GmPLPl-i中有2961个和1922个差异表达基因（DEG）。其中，604个在GmPLP1-ox和GmPLP1-i中重叠并表现出相反的表达模式（图6D）。GO富集分析表明，这些DEG主要参与细胞壁组织、防御反应、碳水化合物代谢过程、脂质分解代谢过程、氧化还原酶活性、对脱落酸的反应、生长素激活的信号通路、木葡聚糖代谢过程、对盐胁迫的反应和对氧化应激的反应。值得注意的是，在这些差异基因中，与GmPLP1-ox相比，GmPLPl-i中的四个过氧化物酶、两个铁蛋白、三个细胞色素P450、硝酸氧化酶、一个DNA修复蛋白和GmPHOT1显著上调（图6E）。此外，我们选择了过氧化物酶基因Glyma.13G307000、Glyma.12G195500和Glyma.09G156700以及GmPHOT1中三个最显著的差异进行RT-qPCR验证。结果表明，在强光下，这些基因在GmPLP1-i中的表达显著高于在GmPLP1-ox中的表达（图6F），表明GmPLP1也可以调节这些基因参与对强光胁迫的反应。
图6 GmPLP1通过抑制GGP酶活性对大豆高光胁迫负调控。 （A） WT、GmPLP1-ox和GmPLPl-i转基因大豆植株中的内源总AsA水平。（a） 低白光条件（50 μmol/m2/s）。（b） 高白光条件（1800 μmol/m2/s）。 （B） 表型观察和总AsA含量表明，GmPLP1在高光胁迫下抑制了GmVTC2b的功能。 （C） 在WT、GmPLP1-ox和GmPLP1-i转基因大豆幼苗中测量的GGP酶活性。 （D） 显示所示样本之间DEG重叠数量的维恩图。 （E） 可能参与高光反应的基因的标准化mRNA表达水平 （F） 高光条件下转基因大豆中Glyma.13G307000、Glyma.12G195500、Glyna.09G156700和GmPHOT1的相对表达水平。  04 结论 研究证明，GmPLP1通过感知蓝光来调节大豆的光合能力和ROS积累，以适应光强的变化。提出了一个假设模型来说明我们的发现（图7）。GmPLP1通过调节植物的光合能力参与对高光胁迫的抗性。 在HBL条件下，GmPLP1的表达水平降低，而GmVTC2b的表达水平显著积累。HBL抑制了GmPLP1和GmVTC2b的相互作用，导致GGP酶活性显著增加，并促进ASA在大豆叶片中的积累。最后，GmPLP1通过减少ROS的积累增强了对高光胁迫的耐受性。
图7 GmPLP1。 箭头表示促进，T形叉表示抑制，线条表示蛋白质-蛋白质相互作用。 05 原文获取 原文链接： https://onlinelibrary./doi/10.1111/pbi.14158 PDF获取： https://onlinelibrary./doi/epdf/10.1111/pbi.14158 |
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