用于恢复土壤健康和控制害虫的基于微生物的组合物的制作方法

用于恢复土壤健康和控制害虫的基于微生物的组合物
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年8月12日提交的美国临时专利申请第62/885,455号和2019年12月26日提交的第62/953,632号的优先权，上述申请均以全文引用的方式并入本文中。


背景技术：

3.在农业行业，某些常见问题阻碍了农民在保持低成本的同时最大限度地提高产量的能力。这些包括但不限于：由细菌、真菌和其它害虫和病原体引起的感染和侵扰；化肥和除草剂的高成本，包括其对环境和健康的影响；以及植物难以高效地从不同类型的土壤中吸收养分和水分。
4.尤其是高效的养分和水分吸收对于生产茁壮成长的作物至关重要，特别是在土壤类型具有某些不适合种植作物的品质的不同地理区域。存在几种不同类型的土壤，由其中存在的粘土、淤泥或沙粒的数量决定。
5.粘质土含有高百分比的粘土和淤泥。颗粒小且紧贴在一起，很好地保留了水分和养分；然而，粘质土容易被压实，其中矿物颗粒被上覆沉积物的重量挤压在一起，从而降低了土壤的孔隙率。这会阻碍植物的根部穿透土壤，以及水分和养分到达根部的能力。此外，粘质土的排水速度比其它土壤类型慢，并且在经历寒冷和冰冻温度的地区，春季可能需要更长的时间才能升温或解冻。粘质土可以通过其粘性、光滑的稠度以及其粘附在园艺工具上的倾向来识别。
6.沙质土由比粘质土更大、更粗的颗粒构成。其水分和养分保持能力低，因此施肥和浇水必须比其它类型的土壤更频繁。沙质土通常不如其它土壤类型肥沃，因为颗粒之间存在较大的间隙。这些间隙使水分和养分质更容易流失。这种类型的土壤可以通过其粗糙的质地，以及其在被握住时散开而不是粘在一起的倾向来识别。
7.壤土具有粘土、淤泥、沙子和有机物质的平衡，使其成为园艺用途最理想的土壤类型，以及农业用途最肥沃的土壤。它能够很好地保持水分和营养。壤土也是透气的，意味着空气可以在土壤中循环，并且水可以更容易地排出。其可以通过轻轻挤压时保持其形状的能力来识别，并且比其它土壤类型更容易挖掘。
8.另外两种土壤类型，粉质土和泥炭土，以造成排水困难而闻名。粉质土通常具有类似于壤土的保水能力；然而，取决于粘土与淤泥的比例，水可能会流失得更慢。泥炭土最常见于沼泽、潮湿的气候地区。泥炭土虽然营养丰富，但很容易发生内涝。
9.土壤的类型和组成是决定特定植物和/或作物能否茁壮成长的重要因素。有时，需要称为土壤改良剂的添加剂来根据特定需求改善特定类型作物的土壤。土壤改良剂是一种可改善其所施土壤的物理和/或化学特征的组合物。土壤改良剂可以减少压实，给土壤充气，并且使水分和养分更容易通过土壤到达植物根部。一些土壤改良剂还为土壤添加养分、调节盐度和/或帮助保持水分。
10.土壤改良剂可包含有机物质，例如泥炭藓、腐殖质、肥料、堆肥、表土以及各种矿物质和沙子。目前，在向土壤中添加材料时，必须达到材料的平衡，以便为土壤提供适量的保
水性并在土壤中提供所需的通气量，从而更好地促进植物生长。例如，土壤必须具有足量的保水材料，同时必须具有足够的可排水性，以防止过多的水分破坏和阻碍植物生长。
11.土壤还必须足够致密以维持根部结构和支持植物，但同时必须足够松散以使根部扩张并支持植物生长。此外，土壤必须含有适量的盐分，以及例如氮、磷酸盐、钙、铜和铁等矿物质。
12.除了土壤的特性，防治害虫也是生产作物的一个重要方面。然而，使用杀虫剂有污染土壤和农产品的风险，但可能对人类有害，并可能无意中伤害有益物种。此外，某些化学杀虫剂的过度依赖和长期使用会改变土壤生态系统，降低抗逆性，增强害虫抗性，并且阻碍植物和动物的生长和活力。
13.越来越多的监管要求对化学品和/或抗生素的可用性和使用进行管理，以及消费者对于生产对环境危害最小的无残留、可持续种植的食品的需求，正在影响害虫防治行业并引起关于如何应对无数挑战的思想的演变。对更安全的杀虫剂和替代害虫防治策略的需求正在增加。虽然目前大规模消除化学品是不可行的，但农民越来越接受使用生物措施作为综合营养管理和综合害虫管理计划的可行组成部分。
14.为了满足全球对生产食品和消费品的可持续方法的需求，例如细菌、酵母和真菌等微生物以及其副产品正成为化学农业应用中越来越有用的替代品。例如，农民正在接受使用生物制剂，例如活微生物、源自这些微生物的生物产品和其组合，作为土壤改良剂、生物杀虫剂和生物肥料。与传统化学品相比，这些生物制剂的危害更小，它们更高效并且更专一，而且它们通常可以快速生物降解，从而减少土壤和环境污染。
15.当前作物生产方法的经济成本以及对健康和环境的不利影响继续对生产食品和其它以作物为基础的消费品的可持续性和努力造成负担。环境意识和消费者需求促进了对用于例如增强土壤特征和/或防治害虫的改良产品的探索。


技术实现要素：

16.本发明提供多功能农业组合物和其用于增强土壤健康以及在土壤中生长的植物的健康的方法。有利地，本发明的基于微生物的产品和方法是环境友好的、无毒的以及有成本效益的。
17.在优选的实施例中，本发明提供了用于增强土壤肥力和/或健康的组合物。在一些实施例中，组合物还可用作例如杀虫剂、植物免疫调节剂和/或植物生长刺激剂。
18.在某些实施例中，组合物包含一种或多种有益微生物和/或一种或多种微生物生长副产物，例如生物表面活性剂、酶和/或其它代谢物。组合物还可以包含在其中产生微生物的发酵培养基。
19.组合物可以配制用于施用于土壤和/或地上和地下植物部分。例如，在某些实施例中，组合物可以与水混合并通过灌溉系统施用于植物和/或土壤。
20.微生物可以是活的和/或灭活的。在优选的实施例中，有益微生物是酵母和/或细菌。在一个具体实施例中，该组合物可包含球拟假丝酵母(starmerella bombicola)。
21.在一些实施例中，酵母提取物和/或通过微生物领域已知的方法产生的其它微生物水解物包括在组合物中。
22.在某些实施例中，微生物生长副产物是选自例如以下各者的生物表面活性剂：糖
脂(例如槐糖脂、纤维二糖脂、鼠李糖脂、甘露糖基赤藓糖醇脂和海藻糖脂)、脂肽(例如表面活性素、伊枯草菌素、丰原素和地衣素)、黄酮脂、脂肪酸酯、磷脂(例如心磷脂)和高分子量聚合物，例如脂蛋白、脂多糖-蛋白质复合物和多糖-蛋白质-脂肪酸复合物。
23.组合物可包含一种或多种生物表面活性剂，其浓度为例如按重量计0.001％至10％、0.01％至5％、0.05％至2％和/或0.1％至1％。在某些具体实施例中，生物表面活性剂是糖脂和/或脂肽。
24.本发明的基于微生物的组合物可以通过从小规模到大规模的培养过程获得。这些培养过程包括但不限于深层培养/发酵、固态发酵(ssf)和其组合。
25.在优选的实施例中，本发明提供了用于增强土壤和/或植物健康的方法，其中组合物与土壤和/或植物接触，所述组合物包含一种或多种微生物和/或一种或多种微生物生长副产物，例如生物表面活性剂、酶和/或其它代谢物。组合物还可包含在其中产生微生物的发酵培养基，例如深层发酵液或固态底物。
26.在某些实施例中，生长副产物是生物表面活性剂，例如糖脂和/或脂肽。
27.微生物在施用时可以是活的、休眠的或无活性的。在一些实施例中，微生物呈酵母提取物和/或另一种微生物水解物的形式。
28.微生物生长副产物可以是由微生物产生的那些，和/或其可外加由组合物的微生物产生的生长副产物进行施用。
29.所述方法可以进一步包含在施用之前、期间和/或之后添加材料以增强微生物生长(例如，添加养分和/或益生元)。因此，活的微生物可以原位生长并就地产生活性化合物。因此，可以在土壤中轻松且连续地实现高浓度的微生物和其生长副产物。
30.在一些实施例中，所述方法包含将一种或多种微生物生长副产物施用于没有微生物的土壤和/或植物。具体而言，在一个实施例中，所述方法包含将包含纯化的糖脂和/或脂肽生物表面活性剂的组合物施用于土壤和/或植物。
31.在一些实施例中，所述方法用于恢复土壤健康，其中被处理的土壤曾经是健康的，但在一段时间后恶化。修复可能会使土壤恢复到以前的健康状态和/或增强的健康状态。
32.在某些实施例中，增强土壤健康包含例如以下中的一种或多种：从土壤中去除污染物、改善土壤的养分含量和可用性、改善土壤的排水和/或保水特性、改善土壤的盐度、改善土壤微生物组的多样性和/或防治土传害虫。
33.在一些实施例中，所述方法用于控制地上和地下害虫。在一些实施例中，所述方法可用于防治害虫，例如节肢动物、线虫、原生动物、细菌、真菌和/或病毒。
34.在一些实施例中，所述方法用于刺激植物的生长和/或提高植物战胜杂草和其它有害植物的能力。
35.基于微生物的产品可以单独使用或与其它化合物组合使用，以高效地增强土壤和/或植物健康。例如，在一些实施例中，所述方法包含向土壤和/或植物施用另外的组分，例如除草剂、肥料、杀虫剂和/或其它土壤改良剂。确切的材料和其数量可由例如受益于本公开的种植者或土壤科学家确定。
36.在某些实施例中，当使用整个微生物培养物时，本发明的组合物具有优于例如单独的生物表面活性剂的优点。这些优点可以包括以下中的一项或多项：高浓度甘露糖蛋白作为酵母细胞壁外表面的一部分；在酵母细胞壁中存在β-葡聚糖；在组合物中包括发酵液
和/或固体底物；以及在组合物中存在例如蛋白质、酶、养分、其它代谢物。
37.有利地，可以使用本发明而不会将大量污染化合物释放到环境中。事实上，在一些实施例中，本发明可用于通过改进的农业实践来减少温室气体和其它大气污染物的排放。此外，所述组合物和方法使用可生物降解和毒理学安全的组分。因此，本发明可用作“绿色”农产品。
具体实施方式
38.本发明提供微生物、其生长的副产物，例如生物表面活性剂，以及使用这些微生物和其副产物的方法。更具体地，本发明提供基于微生物的组合物和其用于增强土壤和/或植物健康的方法。有利地，本发明的基于微生物的产品和方法是环境友好的、无毒的以及有成本效益的。
39.选定的定义
40.本发明使用“基于微生物的组合物”，意指包含由于微生物或其它细胞培养物的生长而产生的组分的组合物。因此，基于微生物的组合物可以包含微生物本身和/或微生物生长的副产物。微生物可以处于植物状态、孢子或分生孢子形式、菌丝形式、任何其它繁殖体形式或这些的混合物。微生物可以是浮游的或呈生物膜形式，或两者的混合物。生长的副产物可以是例如代谢物、细胞膜成分、表达的蛋白质和/或其它细胞成分。微生物可以是完整的或溶解的。在一些实施例中，微生物与其所生长的生长培养基一起存在于基于微生物的组合物中。例如，微生物可以至少1
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或更多cfu每克或每毫升组合物的浓度存在。
41.本发明进一步提供了“基于微生物的产品”，其为欲在实践中施用以实现期望结果的产品。基于微生物的产品可以简单地是从微生物培养过程中收获的基于微生物的组合物。或者，基于微生物的产品可包含已添加的其它成分。这些额外成分可包括例如稳定剂、缓冲剂、适当的载体(例如水、盐溶液)、支持进一步微生物生长的添加养分、非养分生长促进剂和/或有助于追踪微生物和/或其施用环境中的成分的试剂。基于微生物的产品还可以包含基于微生物的组合物的混合物。基于微生物的产品还可以包含已经以某种方式加工的基于微生物的组合物的一种或多种成分，所述方式例如但不限于过滤、离心、裂解、干燥、纯化等。
42.如本文所用，“生物膜”是微生物的复杂聚集体，其中细胞彼此粘附和/或粘附至表面。在一些实施例中，细胞分泌围绕整个聚集体的多糖屏障。生物膜中的细胞在生理上不同于同一生物体的浮游细胞，浮游细胞是可以在液体培养基中漂浮或游动的单细胞。
43.如本文所用，“分离的”或“纯化的”化合物，例如多核苷酸或多肽基本上不含在自然界中与所述组合物相关和/或在其中产生所述化合物的其它化合物，例如细胞材料、基因、基因序列、氨基酸或氨基酸序列。在微生物菌株的上下文中，“分离的”是指菌株从其在自然界中存在和/或培养其的环境中去除。因此，分离的菌株可作为例如生物学纯培养物或孢子(或菌株的其它形式)存在。
44.如本文所用，“生物学纯培养物”是已经从在自然界中与所述培养物相关和/或在其中培养所述培养物的材料分离的培养物。在一个优选实施例中，培养物已从所有其它活细胞中分离。在另外的优选实施例中，与自然界中存在的相同微生物的培养物相比，生物纯
培养物具有有利的特征。有利的特征可以是例如一种或多种生长副产物的产量增加。
45.在某些实施例中，纯化的化合物是感兴趣化合物的至少60重量％。优选地，所述制剂是感兴趣化合物的至少75重量％，更优选至少90重量％，并且最优选至少99重量％。例如，纯化的化合物是所需化合物重量的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、98％、99％或100％(w/w)。纯度是通过任何合适的标准方法测量，例如通过柱色谱法、薄层色谱法或高效液相色谱法(hplc)分析。
[0046]“代谢物”是指代谢产生的任何物质(例如，生长副产物)或参与特定代谢过程所必需的物质。代谢物的实例包括但不限于生物表面活性剂、生物聚合物、酶、酸、溶剂、醇、蛋白质、维生素、矿物质、微量元素和氨基酸。
[0047]
如本文所用，“调节”意指引起改变(例如，增加或减少)。
[0048]
本文提供的范围被理解为范围内所有值的简写。例如，1到20的范围被理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20组成的组的任何数字、数字组合或子范围，以及所有介于上述整数之间的十进制值，例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9。关于子范围，从范围的任一端点延伸的“嵌套子范围”被具体考虑。例如，示例性范围1到50的嵌套子范围可包括在一个方向上的1到10、1到20、1到30和1到40，或在另一个方向的50到40、50到30、50到20和50到10。
[0049]
如本文所用，“减少”是指负改变，且“增加”是指正改变，各为至少1％、5％、10％、25％、50％、75％或100％。
[0050]
如本文所用，“参考”是指标准或对照条件。
[0051]
如本文所用，“表面活性剂”是指降低两种液体之间、液体与气体之间或液体与固体之间的表面张力(或界面张力)的化合物。表面活性剂用作例如去污剂、润湿剂、乳化剂、发泡剂和分散剂。“生物表面活性剂”是由活生物体产生的表面活性剂。
[0052]
如本文所用，“农业”是指用于食品、纤维、生物燃料、药物、化妆品、补充剂、观赏目的和其它用途的植物、藻类和/或真菌的培养和繁殖。根据本发明，农业还可以包括园艺、景观美化、园林、植物保护、果园种植和树木栽培。农业还包括对土壤的照料、监测和维护。
[0053]
如本文所用，“预防(preventing/prevention)”情况或事件意指延迟、抑制、预防、阻止和/或最小化所述情况或事件的发生、广泛性或进展。预防可包括但不要求无限期、绝对或完全预防，意味着情况或事件可能仍会在以后发展。预防可包括降低此类情况或事件发生的严重性，和/或抑制其进展到更严重或更广泛的情况或事件。
[0054]
如本文所用，用于害虫的术语“防治”意指杀死、致残、固定或减少害虫的种群数量，或以其它方式使害虫基本上不能造成伤害和/或繁殖。
[0055]
如本文所用，“害虫”是除人类之外的任何对人类或人类关注(例如农业、园艺)具有破坏性、有害和/或不利的生物。在一些但不是所有情况下，害虫可能是病原生物。害虫可能导致或成为感染、侵扰和/或疾病的媒介，或者它们可能只是以活组织为食或对活组织造成其它物理伤害。害虫可以是单细胞或多细胞生物，包括但不限于病毒、真菌、细菌、寄生虫、节肢动物、原生动物和/或线虫。
[0056]
如本文所用，“土壤改良剂”或“土壤调理剂”是添加到土壤中以增强土壤的物理和/或化学性质的任何化合物、材料或化合物或材料的组合。土壤改良剂可包括有机和无机物质，并且可进一步包括例如微生物、肥料、杀虫剂和/或除草剂。营养丰富、排水良好的土
壤对于植物的生长和健康至关重要，并且因此，土壤改良剂可用于通过例如改变土壤的养分和水分含量来增强植物的生长和健康。土壤改良剂也可用于增强土壤健康和/或肥力。
[0057]
如本文所用，“增强”意指改善或增加。例如，增强的土壤健康意味着改善的物理结构(例如，孔隙率、渗透性、体积)、改善的肥力(例如，矿物质含量、养分含量、有机质含量)、改善的润湿性和/或排水性、改善的盐度、改善的土壤生物多样性和/或去除或减少污染物和/或害虫。在一些实施例中，增强的土壤健康取决于欲在土壤中生长的特定作物所需的特征。例如，一些植物喜欢更高的排水性，而另一些则喜欢更潮湿的土壤。
[0058]
作为另一个实例，增强的植物健康意味着提高植物生长和茁壮成长的能力，包括提高种子发芽和/或出苗；提高抵御害虫和/或疾病的能力；提高在环境压力，例如干旱和/或过度浇水下生存的能力；提高达到所需大小和/或质量的能力；增加每株植物的果实、叶子、根、提取物和/或块茎的数量和/或大小；和/或提高果实、叶子、根、提取物和/或块茎的质量(例如，改善味道、质地、白利糖度、叶绿素含量和/或颜色)。
[0059]
与“包括”或“含有”同义的过渡性术语“包括”是包容性的或开放式的，并且不排除附加的、未列举的要素或方法步骤。相比之下，过渡性短语“由
……
组成”不包括权利要求书中未指定的任何要素、步骤或成分。过渡性短语“基本上由
……
组成”将权利要求书的范围限制为指定的材料或步骤，“以及那些不实质影响要求保护的发明的基本和新颖特征的材料或步骤”。术语“包含”的使用涵盖了“由”或“基本上由”所列举的成分“组成”的其它实施例。
[0060]
除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用，术语“或”被理解为具有包容性。除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用，术语“一”、“和”以及“该”被理解为单数或复数。
[0061]
除非特别说明或从上下文显而易见，否则如本文所用，术语“约”被理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。约可以理解为在规定值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。
[0062]
本文中的任何变量定义中对化学基团列表的叙述包括将所述变量定义为任何单个基团或所列基团的组合。本文中对变量或方面的实施例的叙述包括作为任何单个实施例或与任何其它实施例或其部分组合的实施例。
[0063]
本文中引用的所有参考文献均特此以全文引用的方式并入。
[0064]
组合物
[0065]
在优选的实施例中，本发明提供了用于增强土壤健康和/或在其中生长的植物健康的组合物。在一些实施例中，组合物还可用作例如杀虫剂、植物免疫调节剂和/或植物生长刺激剂。
[0066]
在某些实施例中，组合物包含一种或多种有益微生物和/或一种或多种微生物生长副产物，例如生物表面活性剂、酶和/或其它代谢物。组合物还可以包含在其中产生微生物的发酵培养基。
[0067]
微生物可以是例如细菌、酵母和/或真菌。这些微生物可以是天然的或基因修饰的微生物。例如，可以用特定基因转化微生物以表现出特定特征。微生物也可以是所需菌株的突变体。如本文所用，“突变体”意指参考微生物的菌株、遗传变体或亚型，其中与参考微生物相比，突变体具有一个或多个遗传变异(例如，点突变、错义突变、无义突变、缺失、复制、
移码突变或重复扩增)。制备突变体的程序在微生物学领域是众所周知的。例如，uv诱变和亚硝基胍被广泛用于此目的。
[0068]
在一个实施例中，微生物是酵母或真菌。适合根据本发明使用的酵母和真菌种类包括短梗霉(例如出芽短梗霉(a.pululans))、布拉霉属、假丝酵母属(例如蜂生假丝酵母(c.apicola)、水解假丝酵母(c.bombicola)、耐盐假丝酵母(c.nodaensis))、隐球菌属、德巴利酵母属(例如，汉氏德巴利酵母(d.hansenii))、虫霉属、有孢汉逊酵母属(例如葡萄汁有孢汉逊酵母(h.uvarum))、汉逊酵母属、伊萨酵母属、克鲁维酵母属(例如法菲克鲁维酵母(k.phaffii))、被孢霉属、菌根、季也蒙酵母(meyerozyma guilliermondii)、青霉属、须霉属、毕赤酵母属(例如异常毕赤酵母(p.anomala)、季也蒙毕赤酵母(p.guilliermondii)、西方毕赤酵母(p.occidentalis)、库德毕赤酵母(p.kudriavzevii))、侧耳属(例如糙皮侧耳(p.ostreatus))、拟酵母属(例如蚜虫拟酵母)、酵母菌(例如布拉酵母菌(s.boulardii sequela)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、圆酵母(s.torula))、斯塔莫酵母(例如球拟假丝酵母)、球拟酵母属、木霉属(例如里氏木霉(t.reesei)、哈茨木霉(t.harzianum)、钩状木霉(t.hamatum)、绿色木霉(t.viride))、黑粉菌属(例如玉蜀黍黑粉菌(u.maydis))、异常威克汉姆酵母属(例如异常威克汉姆酵母(w.anomalus))、拟威尔酵母属(例如马基拟威尔酵母(w.mrakii))、接合酵母属(例如巴利接合酵母(z.baili))等。
[0069]
在某些实施例中，微生物是细菌，包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。细菌可以是例如土壤杆菌属(例如放射形土壤杆菌(a.radiobacter))、固氮菌属(棕色固氮菌(a.vinelandii)、褐球固氮菌(a.chroococcum))、固氮螺菌属(例如巴西固氮螺菌)、芽孢杆菌(例如，解淀粉芽孢杆菌、圆形芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌(b.firmus)、侧孢芽孢杆菌(b.laterosporus)、地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)、巨大芽孢杆菌(b.megaterium)、摩加夫芽孢杆菌(bacillus mojavensis)、胶冻样芽孢杆菌(b.mucilaginosus)、枯草芽孢杆菌(b.subtilis))、伯克氏菌(例如泰国伯克氏菌(burkholderia thailandensis))、弗拉托氏菌属(例如金黄弗拉托氏菌(f.aurantia))、微杆菌属(例如产左聚糖微杆菌(mlaevaniformans))、粘细菌(例如黄色粘球菌、桔黄斯蒂拉菌(stignatella aurantiaca)、纤维堆囊菌(sorangium cellulosum)、玫瑰小囊虫(minicystis rosea))、多粘类芽孢杆菌、泛菌属(例如成团泛菌(p.agglomerans))、假单胞菌(例如铜绿假单胞菌、绿针假单胞菌亚属金色(p.chlororaphis subsp.aureofaciens)(克鲁维)、恶臭假单胞菌)、根瘤菌属、红螺菌属(例如深红红螺菌)、鞘氨醇单胞菌(例如少动鞘氨醇单胞菌(s.paucimobilis))和/或氧化硫硫杆菌(thiobacillus thiooxidans)(嗜酸性氧化硫硫杆菌(acidothiobacillus thiooxidans))。
[0070]
在某些实施例中，组合物包含球拟假丝酵母(starmerella bombicola)，其为糖脂生物表面活性剂，如槐糖脂的有效生产者。
[0071]
在某些实施例中，组合物包含酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，其可以被影响以产生糖脂生物表面活性剂，例如槐糖脂和/或鼠李糖脂。
[0072]
在某些实施例中，组合物包含能够产生生物乳化化合物、蛋白酶以及丰原素和/或表面活性素生物表面活性剂的产生脂肽的细菌，例如摩加夫芽孢杆菌(bacillus mojavensis)。
[0073]
在某些实施例中，组合物包含黄色粘球菌(myxococcus xanthus)，一种产生脂肽
的土壤细菌。
[0074]
在某些实施例中，组合物包含解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)nrrl b-67928，其除了有助于溶解土壤中的养分的有机酸外，还能够产生表面活性素、伊枯草菌素、地衣菌素和丰原素。
[0075]
在某些实施例中，组合物包含泰国伯克氏菌，其可以被影响以产生鼠李糖脂生物表面活性剂。
[0076]
根据本发明可以使用其它微生物菌株，包括例如在其细胞壁中具有高浓度甘露糖蛋白和/或β-葡聚糖和/或能够产生生物表面活性剂、酶、养分和其它可用于增强土壤健康、防治害虫和/或增强植物健康的代谢物的任何其它菌株。
[0077]
本发明的基于微生物的组合物可以通过从小规模到大规模的培养过程获得。这些培养过程包括但不限于深层培养/发酵、固态发酵(ssf)和其组合。
[0078]
在某些实施例中，基于微生物的组合物可包含含有微生物培养物和/或由微生物产生的微生物代谢物和/或任何残留养分的发酵液和/或固态底物。发酵产物可直接使用，无需提取或纯化代谢物。如果需要，可以使用文献中描述的标准提取和/或纯化方法或技术轻松实现提取和纯化。
[0079]
按重量计，组合物可以是培养液和/或固体底物的至少1％、5％、10％、25％、50％、75％或100％。按重量计，组合物中的生物质的量可以是0％至100％的任何量，包括其间的所有百分比，例如，5g/l至180g/l或更多，或10g/l至150g/l。
[0080]
微生物可以是活的和/或灭活的。在一些实施例中，组合物包含灭活的微生物，例如呈酵母提取物和/或另一种微生物水解物的形式。根据本发明，微生物的“水解产物”包含失活微生物的破坏的细胞壁/膜，以及从其释放的细胞内容物。灭活或水解过程通常会导致化合物从细胞和细胞壁/膜中释放出来，例如代谢物、酶、蛋白质、肽、游离氨基酸、维生素、矿物质和微量元素。
[0081]
优选地，使微生物灭活的方式也不会使其在培养过程中产生的生化物质灭活或变性。灭活可以使用例如煮沸、干热烘箱、高压灭菌、巴氏杀菌、冷藏、冷冻、高压处理、高压氧疗法、干燥、冻干、辐射、超声、hepa(高效微粒空气)过滤或膜过滤来实现。
[0082]
在某些实施例中，本发明组合物的微生物生长副产物是选自例如糖脂(例如槐糖脂、纤维二糖脂、鼠李糖脂、甘露糖基赤藓糖醇脂和海藻糖脂)、脂肽(例如表面活性素、伊枯草菌素、丰原素、节活性素(arthrofactin)和地衣素)、黄酮脂、脂肪酸酯、磷脂(例如心磷脂、磷脂酰甘油)和高分子量聚合物，如脂蛋白、脂多糖-蛋白质复合物和多糖-蛋白质-脂肪酸复合物。
[0083]
在某些实施例中，生物表面活性剂是槐糖脂。槐糖脂是糖脂生物表面活性剂，例如由斯塔莫酵母进化枝的各种酵母产生。slp由与长链羟基脂肪酸连接的二糖槐糖组成。其可包含部分乙酰化的2-o-β-d-吡喃葡萄糖基-d-吡喃葡萄糖单元，以β-糖苷方式连接到17-l-羟基十八烷酸或17-l-羟基-δ9-十八碳烯酸。羟基脂肪酸通常为16或18个碳原子，并且可以包含一个或多个不饱和键。此外，槐糖残基可以在6-和/或6'-位置乙酰化。脂肪酸羧基可以是游离的(酸性或直链形式)或在4
”‑
位内部酯化(内酯形式)。
[0084]
在一些实施例中，slp、球拟假丝酵母和产生slp的底物已被美国食品和药物管理局授予gras(通常认为安全)状态。在一个实施例中，slp的毒性剂量为》375mg/kg体重。
[0085]
在某些实施例中，生物表面活性剂是鼠李糖脂(rlp)。rlp是包含鼠李糖部分和3-(羟基烷酰氧基)链烷酸脂肪酸尾的糖脂。存在两大类鼠李糖脂，单鼠李糖脂和二鼠李糖脂，其分别具有一个或两个鼠李糖基团。脂肪酸尾的支化长度和程度也可能因rlp分子而异。最常见地，rlp是使用铜绿假单胞菌产生的。然而，铜绿假单胞菌是人类和一些植物的已知病原体。
[0086]
在某些实施例中，生物表面活性剂是甘露糖基赤藓糖醇脂质(mel)。mel是糖脂生物表面活性剂，其包含作为亲水部分的4-o-b-d-吡喃甘露糖基-内消旋赤藓糖醇或1-o-b-d-吡喃甘露糖基-内消旋赤藓糖醇，以及作为疏水部分的脂肪酸基团和/或乙酰基。通常在甘露糖残基的c4和/或c6上的一个或两个羟基可以被乙酰化。此外，可存在一至三个酯化脂肪酸，链长为8至12个碳或更多。
[0087]
mel分子可以合成或自然方式进行修饰。例如，mel可包含不同碳长度的链或不同数量的乙酰基和/或脂肪酸基团。分子可相应地分组：mel a(二乙酰化)、mel b(在c4处单乙酰化)、mel c(在c6处单乙酰化)、mel d(非乙酰化)、三乙酰化mel a和三乙酰化mel b/c。其它表现出相似结构和相似特性的mel样分子可包括甘露糖基-甘露醇脂质(mml)、甘露糖基-阿拉伯糖醇脂质(mal)和/或甘露糖基-核糖醇脂质(mrl)。mel通常由酵母“蚜虫拟酵母(pseudozyma aphidis)”产生。
[0088]
在某些实施例中，生物表面活性剂是脂肽。脂肽是由细菌使用大型多酶复合物合成的寡肽。其经常用作抗生素化合物，并且除表面活性剂活性外，还表现出广泛的抗菌谱。所有脂肽都有一个共同的环状结构，所述结构由整合到肽部分的β-氨基或β-羟基脂肪酸组成。许多芽孢杆菌属细菌菌株能够产生脂肽，例如枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。
[0089]
最常研究的脂肽家族，即表面活性素家族，由含有具有13至15个碳原子的β-羟基脂肪酸的七肽组成。表面活性素被认为是一些最强大的生物表面活性剂。其具有一定的抗病毒活性以及抗真菌活性，并且当与另一种脂肽伊枯草菌素a结合使用时，其表现出很强的协同作用。此外，表面活性素也可能是建立稳定生物膜的关键因素，同时还能抑制其它细菌，包括革兰氏阴性菌的生物膜形成。
[0090]
包括制磷脂菌素(plipastatin)的丰原素家族包含具有β-羟基脂肪酸的十肽。丰原素表现出一些不寻常的特性，例如肽部分中存在鸟氨酸。其具有抗真菌活性，但对丝状真菌更具特异性。
[0091]
伊枯草菌素家族，以例如伊枯草菌素a、抗霉枯草菌素和杆菌霉素为代表，是具有β-氨基脂肪酸的七肽。伊枯草菌素还表现出很强的抗真菌活性。
[0092]
已经鉴定了其它脂肽，其表现出多种有用的特征。这些包括但不限于库斯塔克(kurstakins)、节活性素(arthrofactin)、粘液菌素、球孢黑粉菌素(glomosporin)、两性霉素(amphisin)和丁香霉素，仅举几例。
[0093]
有利地，在一些实施例中，生物表面活性剂由于其降低内聚和/或粘合表面张力的能力而用作润湿剂，即使在疏水性土壤中也是如此。这使水能够更均匀地分散并渗透到土壤中。此外，由于例如某些类型的生物表面活性剂的抗细菌、抗病毒、抗线虫和/或抗真菌能力，生物表面活性剂可以用作生物杀虫剂。此外，生物表面活性剂是可生物降解的，从而减少和/或消除因应用化学润湿剂、杀虫剂和/或其它化学农业处理剂而产生的负面影响。
[0094]
组合物可包含浓度为例如0.001％至10％、0.01％至5％、0.05％至2％和/或0.1％
至1％重量的一种或多种生物表面活性剂。
[0095]
为改善或稳定组合物的效果，可将其与合适的助剂混合，且接着根据需要原样使用或稀释后使用。在一个实施例中，如果产品以干燥形式使用，则组合物可包含葡萄糖(例如，以糖蜜的形式)、丙三醇和/或甘油作为渗透物质或外加渗透物质，以在储存和运输过程中提高渗透压。
[0096]
组合物可以单独使用或与其它化合物和/或方法组合使用，以高效地增强土壤健康和/或植物健康、生长和/或产量。例如，在一个实施例中，组合物可包括以下各者和/或可与以下各者同时施用：用于增强植物和/或微生物生长的养分和/或微量养分，例如镁、磷酸盐、氮、钾、硒、钙、硫、铁、铜和锌；和/或一种或多种益生元，例如海藻提取物、黄腐酸、甲壳素、腐植酸盐和/或腐植酸。确切的材料和其数量可由受益于本公开的种植者或农业科学家确定。
[0097]
组合物还可以与其它农业化合物和/或作物管理系统组合使用。在一个实施例中，组合物可任选地包含例如天然和/或化学杀虫剂、驱虫剂、除草剂、肥料、水处理剂、非离子表面活性剂和/或土壤改良剂，或与其一起施用。
[0098]
基于微生物的产品可以多种方式配制，包括液体、固体、颗粒、粉尘或缓释产品，通过受益于本公开的本领域技术人员将理解的方式。
[0099]
本发明的固体配制物可具有不同的形式和形状，例如圆柱、棒、块、胶囊、片剂、丸剂、小球、条、尖状物等。固体制剂也可以被研磨、粒化或粉化。颗粒状或粉末状材料可压制成片剂或用于填充预先制造的明胶胶囊或壳。半固体配制物可以制备成糊状、蜡状、凝胶状或乳膏状制剂。
[0100]
本发明的固体或半固体组合物可以使用薄膜包衣化合物，例如聚乙二醇、明胶、山梨糖醇、树胶、糖或聚乙烯醇进行包衣。这对于片剂或胶囊剂尤其重要。薄膜包衣可以避免操作者与配制物中的活性成分直接接触。此外，苦味剂如苯甲酸地那铵或苦木素也可掺入配制物、包衣或两者中。
[0101]
本发明的组合物还可以制备成粉末配制物并按原样使用，或任选地填充到预先制造的明胶胶囊中。
[0102]
配制物中的成分的浓度和组合物的施用率可以根据所处理的土壤、植物或区域或施用方法而广泛变化。
[0103]
基于微生物的组合物可以在没有进一步稳定化、保存和储存的情况下使用。有利地，这些基于微生物的组合物的直接使用保持了微生物的高活力，降低了被外来物质和不希望的微生物污染的可能性，并保持了微生物生长副产物的活性。此外，直接使用含有细胞、养分、底物和/或代谢物的微生物培养物增加了组合物为农业目的提供的益处的数量，超出了例如已经提取和纯化的代谢物所赋予的益处。
[0104]
在其它实施例中，组合物(微生物、生长副产物、生长培养基或其组合)可以放置在适当大小的容器中，考虑例如期望用途、预期的施用方法、发酵容器的大小以及从微生物生长设施到使用地点的任何运输方式。因此，其中放置有基于微生物的组合物的容器可以是例如1品脱至1,000加仑或更大。在某些实施例中，容器是1加仑、2加仑、5加仑、25加仑或更大
[0105]
可以将其它组分添加到组合物中，例如缓冲剂、载体、在相同或不同设施中生产的
其它基于微生物的组合物、粘度调节剂、防腐剂、用于微生物生长的养分、示踪剂、杀生物剂、其它微生物、表面活性剂、乳化剂、润滑剂、溶解度控制剂、ph调节剂、防腐剂、稳定剂和抗紫外线剂。
[0106]
基于微生物的组合物的ph应该适合于感兴趣的微生物和/或微生物生长副产物。在一个优选的实施例中，组合物的ph为约3.5至7.0、约4.0至6.8或约5.0至6.5。
[0107]
任选地，组合物可以在使用前储存。储存时间优选较短。因此，储存时间可以小于60天、45天、30天、20天、15天、10天、7天、5天、3天、2天、1天或12小时。在一个优选的实施例中，如果产品中存在活细胞，则将产品储存在凉爽的温度下，例如低于20℃、15℃、10℃或5℃。
[0108]
在某些实施例中，本发明的组合物具有优于例如单独的生物表面活性剂的优点，包括以下中的一种或多种：高浓度甘露糖蛋白作为酵母细胞壁外表面的一部分；酵母细胞壁中存在β-葡聚糖；以及培养物中存在蛋白质、多核苷酸、脂质、氨基酸、维生素、生物表面活性剂和其它代谢物。
[0109]
增强土壤健康和/或植物健康的方法
[0110]
在优选的实施例中，本发明提供了用于增强土壤健康和/或植物健康的方法，其中将包含一种或多种微生物和/或一种或多种微生物生长副产物的组合物施用于土壤和/或植物。在某些实施例中，生长副产物包含生物表面活性剂，例如糖脂和/或脂肽。
[0111]
在优选的实施例中，如前所述，将根据本发明的组合物施用于土壤和/或植物。如本文所用，“施用”组合物或产品，或“处理”环境是指使组合物或产品与目标或部位接触，使得组合物或产品可以对所述目标或部位产生影响。所述影响可以归因于例如微生物生长和/或代谢物、酶、生物表面活性剂或其它生长副产物的作用。
[0112]
在一些实施例中，通过将本发明的组合物撒布在土壤表面上来进行施用。这可以使用标准的撒布机或喷雾器装置进行。在一些实施例中，单个撒布步骤可以完成施用过程，其中所有组分都包括在单一配制物中。在使用两部分或多部分配制物的其它实施例中，可以使用多个撒布步骤。
[0113]
在一个实施例中，可以使用机械作用，例如通过耕作将组合物摩擦、刷涂或加工到土壤中。在更进一步的实施例中，可以在施用组合物之后施用液体，例如施用水。可以使用本领域普通技术人员已知的标准方法将水作为喷雾施用。也可以使用其它液体润湿剂和润湿配制物。
[0114]
在某些实施例中，本文提供的组合物在没有机械掺入的情况下施用于土壤表面。土壤施用的有益效果可以通过降雨、喷灌、漫灌或滴灌来激活，且随后传递到例如植物的根部以影响根部微生物组或促进微生物产物吸收到施用微生物产品的作物或植物的维管系统中。在一个示例性实施例中，本文提供的组合物可通过中心枢轴灌溉系统或通过播种沟上的喷雾高效地施用。
[0115]
在一些实施例中，本文提供的组合物以干燥或液体配制物的形式作为种子处理剂施用或施用于土壤表面，或施用于植物或植物部分的表面(例如施用于植物叶子或根的表面)。
[0116]
所述方法可用于例如农田、牧场、果园、大草原、地块和/或森林。所述方法也可用于含有明显不适合植物生长的土壤的地区，例如过度耕种的土壤和/或尚未实施轮作或不
足以保持土壤肥力的土壤；因过度使用杀虫剂、化肥和/或除草剂而污染的土壤；高盐度土壤；因倾倒或化学品或碳氢化合物泄漏而污染的土壤；和/或因自然或人为原因，包括火灾、洪水、虫害、开发(例如商业、住宅或城市建筑)、挖掘、采矿、伐木、牲畜饲养和其它原因受损的地区的土壤。
[0117]
有利的是，所述方法可以帮助提高农业产量，即使是在枯竭或受损的土壤中；恢复枯竭的绿地，例如牧场、森林、湿地和草原；以及恢复不可耕地，使其可用于耕作、重新造林和/或植物生态系统的自然再生。此外，通过改进农业实践，所述方法可以帮助减少温室气体排放造成的污染。
[0118]
施用的微生物在施用时可以是活的(或有活力的)或无活性的。在一些实施例中，微生物呈酵母提取物和/或另一种微生物水解物的形式。
[0119]
微生物生长副产物可以是由微生物产生的那些，和/或其可外加由组合物的微生物产生的生长副产物进行施用。
[0120]
所述方法可以进一步包含在施用期间添加材料以增强微生物生长(例如，添加养分和/或益生元)。因此，活的微生物可以原位生长并就地产生活性化合物。因此，可以在土壤中轻松且连续地实现高浓度的微生物和其生长副产物。
[0121]
在一些实施例中，所述方法包含将一种或多种微生物生长副产物施用于没有微生物的土壤和/或植物。具体而言，在一个实施例中，所述方法包含将包含粗形式或纯形式糖脂和/或脂肽生物表面活性剂的组合物施用于土壤和/或植物。
[0122]
在一些实施例中，所述方法包含施用完整的微生物培养物，包含在浸没或固态发酵培养基中的灭活细胞。有利地，这减少了在本发明组合物的生产过程中产生的废物量，同时通过去除微生物代谢物的提取和/或纯化步骤来提高生产效率。此外，非活性细胞和残留发酵培养基的加入提供了对于支持土壤和/或植物健康至关重要的有机和无机养分的丰富来源。
[0123]
基于微生物的组合物的施用可以单独进行或与其它化合物的施用组合以增强土壤健康和/或植物健康。例如，商业和/或天然肥料、杀虫剂、除草剂和/或其它土壤改良剂可以与基于微生物的组合物一起施用。在某些实施例中，基于微生物的组合物可用于增强其它化合物的有效性，例如，通过促进化合物在土壤中的保留，或允许化合物更均匀地分散在整个土壤中。
[0124]
在其它应用中，可以通过将多种材料混合到土壤中来获得所需的土壤属性，包括例如骨粉、苜蓿、玉米麸质、钾盐和/或来自多种动物(包括马、牛、猪、鸡、蝙蝠、羊)的粪便。可以添加的其它附加元素包括但不限于矿物质养分，例如镁、磷酸盐、氮、钾、硒、钙、硫、铁、铜和锌。确切的材料和其数量可以由土壤科学家确定。
[0125]
在一个实施例中，本发明的基于微生物的组合物分散在土壤中和/或植物上，同时支撑在载体上。载体可以由能够在其上相对温和地保留微生物并因此允许由此增殖的微生物易于释放的材料制成。载体优选地是廉价的并且可以作为如此施用的微生物的营养源，特别是可以逐渐释放的营养源。优选的可生物降解载体材料包括玉米壳、制糖工业废料或任何农业废料。载体的水含量通常为1重量％至99重量％，优选5重量％至90重量％，更优选10重量％至85重量％。
[0126]
也可以将增强微生物生长和生物表面活性剂产生的物质添加到基于微生物的产
品和/或处理部位。这些物质包括但不限于油、甘油、糖或其它养分。例如，可以将支持产生生物表面活性剂的微生物生长的碳底物添加到组合物或目标区域中。产生生物表面活性剂的生物可以在底物上生长以在适当的位置产生生物表面活性剂。
[0127]
尽管不是必需的，但最好用足量的特定生物表面活性剂掺入或改良碳底物以启动乳化过程并抑制或减少产生生物表面活性剂的生物的其它竞争性生物的生长。
[0128]
在某些实施例中，增强土壤健康包含改善土壤的一种或多种品质。这可以包含例如去除和/或减少土壤中的污染物、改善土壤的养分含量和养分利用率、改善土壤的排水和/或保水性能、改善土壤的盐度、改善土壤微生物群落多样性和/或控制土壤传播的害虫。其它改善可以包括增加被风和/或水侵蚀的土壤的体积和/或结构，以及防止和/或延缓土壤被风和/或水侵蚀。
[0129]
在某些实施例中，所述方法包含在根据本发明方法处理土壤之前表征土壤类型和/或土壤健康状态的步骤。因此，所述方法还可包含调整组合物以满足特定的土壤类型和/或土壤健康需要。表征土壤的方法在农艺领域是已知的。
[0130]
微生物生物质，无论是有活性的还是无活性的，都提供了改善土壤物理结构的有机质，例如通过增加体积；有助于减少水和风对土壤的侵蚀；并且可以增加土壤的保水能力，特别是多孔沙质土壤。此外，有活性的和腐烂的微生物生物质对于重质且压实的土壤来说改善了通气，且因此改善了水分/养分的渗透。
[0131]
微生物生物质对土壤的其它益处包括为植物以及其它土壤微生物提供营养源(例如氮、磷、钾、硫等)；由于例如有利的阳离子交换能力而溶解不溶性土壤矿物质，以增加其对植物根部的生物可用性；调节土壤温度；以及缓冲杀虫剂、除草剂和其它重金属残留。
[0132]
在一些实施例中，所述方法用于恢复土壤健康，其中被处理的土壤曾经是健康的，但在一段时间后恶化。修复可能会使土壤恢复到以前的健康状态和/或增强的健康状态。
[0133]
在优选的实施例中，所述方法包含将一种或多种生物表面活性剂施用于土壤。微生物生物表面活性剂是由多种微生物，如细菌、真菌和酵母菌产生的化合物。在某些实施例中，其由基于微生物的组合物的微生物产生。
[0134]
生物表面活性剂降低了液体、固体和气体分子之间的表面和界面张力。生物表面活性剂在土壤生物学中具有巨大的潜力，因为其可生物降解，毒性低，可有效溶解和降解土壤中的不溶性化合物，并且可以使用可再生资源生产。此外，生物表面活性剂还可具有强大的乳化和破乳特性，且可用于获得土壤润湿性，以及实现肥料、养分和水分在土壤中的均匀分布。
[0135]
生物表面活性剂的独特之处在于它们通过微生物发酵生产，但除了其合成类似物不具备的其它属性外，它们还具有化学表面活性剂所具有的那些特性。生物表面活性剂降低了水的汇集趋势，提高了表面的附着力或润湿性，从而使土壤更彻底的水化，并减少了可能通过滴灌和微灌系统形成的微通道在根区下方排出或逸出的水量。这种润湿性还促进了更好的根系健康，因为抑制适当根部生长的干燥(或极度干燥)区域更少，并且随着化学和微量养分更彻底地提供和分配，施用的养分的可用性更好。
[0136]
通过增强的润湿性有可能使土壤中的水分布更均匀，还可以防止水在最佳渗透水平之上积聚或被困，从而减轻抑制氧和碳自由交换的厌氧条件。一旦施用生物表面活性剂，就会形成更多孔或更透气的土壤。适当水合和通气的土壤的组合还增加了土壤害虫和病原
体(例如线虫和土传真菌以及其孢子)对害虫防治剂的敏感性。此外，一些生物表面活性剂具有抗细菌、抗病毒和/或抗真菌特性。因此，生物表面活性剂可用于广泛的有用应用，包括疾病和害虫防治。
[0137]
在某些实施例中，所述方法使得从土壤中去除和/或减少污染物，包括修复被碳氢化合物污染的土壤。在一些实施例中，污染物直接被施用的组合物的微生物降解。在一些实施例中，微生物的生长副产物，例如生物表面活性剂，促进污染物的降解，并且可以与离子和非离子金属螯合并形成络合物以将它们从土壤中释放出来。土壤污染物包括例如残留肥料、杀虫剂、除草剂、杀真菌剂、碳氢化合物、化学品(例如干洗处理剂、城市和工业废物)、苯、甲苯、乙苯、二甲苯和重金属。
[0138]
在一些实施例中，生物表面活性剂用作乳化剂，通过与烃污染物形成稳定的微乳液来增加烃污染物的油-水界面。结果是增加了用于分解微生物的污染物的流动性和生物可用性。
[0139]
所述方法可进一步包含通过使水溶液在土壤中循环来向微生物供应氧气和/或养分，从而刺激所施用的微生物以及天然存在的土壤微生物，以降解污染物和/或产生降解污染物的生长副产物。在一些实施例中，污染的土壤与无害的有机改良物，如粪肥或农业废物结合。这些有机材料的存在支持了丰富的微生物种群的发展和堆肥的高温特性。因此，可以提高生物修复的速率。
[0140]
在某些实施例中，所述方法引起土壤养分含量和植物根部可用性的改善。生物表面活性剂增强了土壤中金属对植物的流动性。此外，微生物生物质，包括活生物质和非活性生物质提供营养源，例如氮、磷和钾(npk)、氨基酸、维生素、蛋白质和脂质。
[0141]
在某些实施例中，所述方法使得干燥的、涝渍的、多孔的、枯竭的、压实的土壤和/或其组合的土壤的排水和/或保水性能得到改善。在一个实施例中，所述方法可以用于改善水在涝渍土壤中的排水和/或分散。在一个实施例中，所述方法可用于改善干燥土壤中的保水性。有利地，在一些实施例中，所述方法有助于减少农业用水量，即使在干旱中也是如此。
[0142]
在一个实施例中，所述方法可用于提高排水性强的沙质和疏水性土壤的保水性。生物表面活性剂通过降低内聚和/或粘性表面张力来润湿这些土壤，使水更均匀地扩散并渗透到土壤中。
[0143]
在某些实施例中，所述方法通过降低盐含量来改善土壤的盐度。盐渍土含有足够的中性可溶性盐，对大多数作物的生长产生不利影响。最常见的可溶性盐是钠、钙和镁的氯化物和硫酸盐。硝酸盐可能很少存在，而许多盐渍土含有相当数量的石膏(caso4,2h2o)。
[0144]
当用低盐水浸出时，一些盐渍土倾向于分散，导致对水和空气的渗透性低，特别是当土壤是重粘土时。微生物和/或生物表面活性剂的存在提高了盐和/或离子的流动性，从而促进盐排放到植物根区下方的深处。
[0145]
在某些实施例中，所述方法还可以通过促进土壤和其中生长的植物根与有益土壤微生物的定殖来帮助改善土壤微生物组多样性。可以促进例如根瘤菌和/或菌根等养分固定微生物以及其它内源性和施用微生物的生长，从而增加土壤微生物组内不同物种的数量。
[0146]
在一些实施例中，所述方法用于防治地上和地下害虫。在一些实施例中，所述方法可用于防治害虫，例如节肢动物、线虫、原生动物、细菌、真菌和/或病毒。在一些实施例中，
所述方法可用于调节植物的免疫系统以激活植物对害虫的先天防御。
[0147]
在一些实施例中，所述方法用于刺激植物生长、增强植物健康和/或产量，和/或提高植物战胜杂草和其它有害植物的能力。
[0148]
微生物的生长
[0149]
本发明利用培养微生物和生产微生物代谢物和/或微生物生长的其它副产物的方法。本发明进一步利用适合以所需规模培养微生物和生产微生物代谢物的培养方法。这些培养过程包括但不限于深层培养/发酵、固态发酵(ssf)以及修饰、杂交和/或其组合。
[0150]
如本文所用，“发酵”是指在受控条件下培养或生长细胞。生长可以是需氧的或厌氧的。在某些实施例中，微生物使用ssf和/或其修饰形式生长。
[0151]
在一个实施例中，本发明提供了用于生产生物质(例如，活细胞物质)、细胞外代谢物(例如，小分子和分泌的蛋白质)、残余养分和/或细胞内成分(例如，酶和其它蛋白质)的材料和方法。
[0152]
根据本发明使用的微生物生长容器可以是工业用途的任何发酵罐或培养反应器。在一个实施例中，容器可以具有功能控制器/传感器或可以连接到功能控制器/传感器以测量培养过程中的重要因素，例如ph、氧气、压力、温度、湿度、微生物密度和/或代谢物浓度。
[0153]
在进一步的实施例中，容器还能够监测容器内微生物的生长(例如，细胞数量和生长期的测量)。或者，可以从容器中取出每日样品，并通过本领域已知的技术，例如稀释平板技术进行计数。稀释平板是一种用于估计样品中的生物数量的简单技术。所述技术还可以提供一个指数，通过所述指数可以比较不同的环境或处理。
[0154]
在一个实施例中，所述方法包括用氮源补充培养。氮源可以是例如硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、磷酸铵、氨、尿素和/或氯化铵。这些氮源可以单独使用或以两种或更多种的组合使用。
[0155]
所述方法可以为生长中的培养物提供氧合。一个实施例利用空气的慢速运动来去除含氧量低的空气并引入含氧空气。在深层发酵的情况下，含氧空气可以是每天通过机构补充的环境空气，所述机构包括用于机械搅拌液体的叶轮和用于将气泡供应到液体以将氧气溶解到液体中的空气喷布器。
[0156]
所述方法可以进一步包括用碳源补充培养。碳源通常是碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇和/或麦芽糖；有机酸，例如乙酸、富马酸、柠檬酸、丙酸、苹果酸、丙二酸和/或丙酮酸；醇，例如乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、异丁醇和/或甘油；脂肪和油，例如大豆油、菜籽油、米糠油、橄榄油、玉米油、芝麻油和/或亚麻子油；等。这些碳源可以单独使用或以两种或更多种的组合使用。
[0157]
在一个实施例中，培养基中包括微生物的生长因子和微量养分。当微生物不能产生所需的所有维生素时，这是特别优选的。无机养分，包括微量元素，例如铁、锌、铜、锰、钼和/或钴也可包括在培养基中。此外，可包括维生素、必需氨基酸和微量元素的来源，例如，以面粉或粗粉的形式，例如玉米粉，或以提取物的形式，例如酵母提取物、马铃薯提取物、牛肉提取物、大豆提取物、香蕉皮提取物等，或以纯化形式。也可以包括氨基酸，例如对蛋白质的生物合成有用的那些。
[0158]
在一个实施例中，还可以包括无机盐。可用的无机盐可以是磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化镁、硫酸铁、氯化铁、硫酸锰、氯化锰、硫酸锌、氯化铅、硫酸铜、
氯化钙、氯化钠、碳酸钙和/或碳酸钠。这些无机盐可以单独使用或以两种或更多种的组合使用。
[0159]
在一些实施例中，用于培养的方法可以进一步包含在培养过程之前和/或期间在培养基中添加额外的酸和/或抗微生物剂。抗微生物剂或抗生素用于保护培养物免受污染。
[0160]
此外，在深层培养的情况下，还可以添加消泡剂以防止泡沫的形成和/或积聚。
[0161]
混合物的ph应适合感兴趣的微生物。缓冲剂和ph调节剂，如碳酸盐和磷酸盐可用于将ph稳定在优选值附近。当金属离子以高浓度存在时，可能需要在培养基中使用螯合剂。
[0162]
微生物可以浮游形式或作为生物膜生长。在生物膜的情况下，容器内可具有底物，微生物可以在其上以生物膜状态生长。所述系统还可以具有例如施加促进和/或改善生物膜生长特征的刺激(例如剪切应力)的能力。
[0163]
在一个实施例中，培养微生物的方法在约5℃至约100℃、优选15至60℃、更优选25至50℃下进行。在进一步的实施例中，可在恒定温度下连续进行培养。在另一个实施例中，培养可以经受变化的温度。
[0164]
在一个实施例中，所述方法和培养过程中使用的设备是无菌的。例如反应器/容器等培养设备可以与灭菌单元(例如高压釜)分离但连接到所述灭菌单元。培养设备还可以具有在开始接种之前就地灭菌的灭菌单元。可以通过本领域已知的方法对空气进行灭菌。例如，环境空气在被引入容器之前可以通过至少一个过滤器。在其它实施例中，可以对培养基进行巴氏杀菌，或者任选地，完全不加热，其中可以利用低水活性和低ph来控制不希望的细菌生长。
[0165]
在一个实施例中，本发明进一步提供一种生产微生物代谢物，例如生物表面活性剂、酶、蛋白质、乙醇、乳酸、β-葡聚糖、肽、代谢中间体、多不饱和脂肪酸和脂质的方法，所述方法通过在适合生长和代谢物生产的条件下培养本发明的微生物菌株；以及任选地，纯化代谢物。通过所述方法产生的代谢物含量可以是例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
[0166]
由感兴趣的微生物产生的微生物生长副产物可以保留在微生物中或分泌到生长培养基中。培养基可含有稳定微生物生长副产物活性的化合物。
[0167]
发酵培养基的生物质含量可以是例如5g/l至180g/l或更多，或10g/l至150g/l。
[0168]
细胞浓度可以是例如至少1
×
106至1
×
10
12
、1
×
107至1
×
10
11
、1
×
108至1
×
10
10
或1
×
109cfu/ml。
[0169]
用于培养微生物和生产微生物副产物的方法和设备可以分批、准连续过程或连续过程进行。
[0170]
在一个实施例中，所有的微生物培养组合物在培养完成后(例如，在例如达到所需的细胞密度或特定代谢物的密度后)被去除。在此分批程序中，在收获第一批时开始一个全新的批次。
[0171]
在另一个实施例中，在任何时候仅去除一部分发酵产物。在此实施例中，具有活细胞、孢子、分生孢子、菌丝和/或菌丝体的生物质作为新培养批次的接种物保留在容器中。去除的组合物可以是无细胞培养基或含有细胞、孢子或其它繁殖体，和/或其组合。以此方式，产生了一个准连续系统。
[0172]
有利地，所述方法不需要复杂的设备或高能耗。感兴趣的微生物可以在现场进行
小规模或大规模的培养和利用，甚至仍然与其培养基混合。
[0173]
有利地，可以在偏远地区生产基于微生物的产品。微生物生长设施可以通过利用例如太阳能、风能和/或水力发电离网运行。
[0174]
基于微生物的产品的制备
[0175]
本发明的一种基于微生物的产品仅仅是含有微生物和/或由微生物产生的微生物代谢物和/或任何残留养分的发酵培养基。发酵产品无需提取或纯化即可直接使用。如果需要，可以使用文献中描述的标准提取和/或纯化方法或技术轻松实现提取和纯化。
[0176]
基于微生物的产品中的微生物可以是活性或非活性形式，或者是营养细胞、生殖孢子、分生孢子、菌丝体、菌丝或任何其它形式的微生物繁殖体的形式。基于微生物的产品还可以含有任何这些形式的微生物的组合。在优选的实施例中，微生物和/或繁殖体是灭活的。
[0177]
在一个实施例中，不同的微生物菌株分别生长，且接着将培养物混合在一起以产生基于微生物的产品。微生物可以任选地与其生长的培养基掺合，并在混合前干燥。
[0178]
在一个实施例中，不同的菌株不混合在一起，而是作为单独的基于微生物的产品施用于土壤。
[0179]
基于微生物的产品可以在不进一步稳定、保存和储存的情况下使用。有利地，这些基于微生物的产品的直接使用保持了微生物的高活力，降低了被外来物质和不希望的微生物污染的可能性，并保持了微生物生长副产物的活性。
[0180]
然而，在一些实施例中，可以从培养物中提取生物表面活性剂和/或其它代谢物，并且任选地进行纯化。在进一步的实施例中，可以将两种或更多种提取的生物表面活性剂和/或其它代谢物混合在一起以形成生物表面活性剂混合液。
[0181]
在从生长容器中收获基于微生物的组合物后，可以在将收获的产品放入容器中或以其它方式运输以供使用时添加其它组分。添加剂可以是例如缓冲剂、载体、在相同或不同设施中生产的其它基于微生物的组合物、粘度调节剂、防腐剂、用于微生物生长的养分、表面活性剂、乳化剂、润滑剂、溶解度控制剂、示踪剂、溶剂、杀生物剂、抗生素、ph调节剂、螯合剂、稳定剂、抗紫外线剂、其它微生物和通常用于此类制剂的其它合适添加剂。
[0182]
在一个实施例中，可以添加缓冲剂，包括有机酸和氨基酸或其盐。合适的缓冲剂包括柠檬酸盐、葡糖酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、乙酸盐、乳酸盐、草酸盐、天冬氨酸盐、丙二酸盐、葡庚糖酸盐、丙酮酸盐、半乳糖酸盐、葡糖二酸盐、酒石酸盐、谷氨酸盐、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、蛋氨酸、半胱氨酸、精氨酸和其混合物。也可使用磷酸和亚磷酸或其盐。适合使用合成缓冲液，但优选使用天然缓冲液，例如上面列出的有机酸和氨基酸或其盐。
[0183]
在进一步的实施例中，ph调节剂包括氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾或碳酸氢钾、盐酸、硝酸、硫酸或混合物。
[0184]
基于微生物的组合物的ph应该适合感兴趣的微生物。在一个优选的实施例中，组合物的ph为约3.5至7.0，或约4.0至6.8，或约5.0至6.5。
[0185]
在一个实施例中，配制物中可包括另外的组分，例如盐的水性制剂，例如碳酸氢钠或碳酸钠、硫酸钠、磷酸钠、磷酸氢钠。
[0186]
在一个实施例中，葡萄糖、丙三醇和/或甘油可以添加到基于微生物的产品中，以在储存和运输期间用作例如渗压剂。在一个实施例中，可包括糖蜜。
[0187]
在一个实施例中，益生元可添加到基于微生物的产品中和/或与基于微生物的产品同时施用以增强微生物生长。合适的益生元包括例如海藻提取物、黄腐酸、甲壳素、腐植酸盐和/或腐植酸。在一个具体实施例中，施用的益生元的量为约0.1l/英亩至约0.5l/英亩，或约0.2l/英亩至约0.4l/英亩。
[0188]
任选地，产品可以在使用前储存。储存时间优选较短。因此，储存时间可以小于60天、45天、30天、20天、15天、10天、7天、5天、3天、2天、1天或12小时。在一个优选的实施例中，如果产品中存在活细胞，则将产品储存在凉爽的温度下，例如低于20℃、15℃、10℃或5℃。
[0189]
基于微生物的产品的当地生产
[0190]
在本发明的某些实施例中，微生物生长设施以期望的规模生产新鲜的高密度微生物和/或感兴趣的微生物生长副产物。微生物生长设施可以位于或靠近施用地点。所述设施以分批、准连续或连续培养的方式生产高密度微生物组合物。
[0191]
本发明的微生物生长设施可以位于将使用基于微生物的产品的位置(例如柑橘园)。例如，微生物生长设施可距使用位置小于300、250、200、150、100、75、50、25、15、10、5、3或1英里。
[0192]
由于基于微生物的产品可以就地生成，无需借助常规微生物生产的微生物稳定、保存、储存和运输过程，因此可生成更高密度的微生物，从而需要更小的基于微生物的产品体积用于现场应用或在必要时允许密度高得多的微生物应用以实现所需的功效。这允许按比例缩小的生物反应器(例如，更小的发酵容器，更少的起始材料、养分和ph控制剂的供应)，这使系统高效，并且可以消除稳定细胞或将细胞与培养基分离的需要。基于微生物的产品的当地生成也有助于将生长培养基包含在产品中。培养基可以含有发酵过程中产生的特别适合当地使用的试剂。
[0193]
当地生产的高密度、稳健的微生物培养物在本现场比在供应链中保留了一段时间的微生物培养物更有效。与传统产品相比，本发明的基于微生物的产品特别有利，其中细胞已与发酵生长培养基中存在的代谢物和营养物分离。运输时间的缩短允许在当地需求所需的时间和数量上生产和交付新鲜批次的微生物和/或其代谢物。
[0194]
本发明的微生物生长设施生产新鲜的、基于微生物的组合物，包含微生物本身、微生物代谢物和/或微生物在其中生长的培养基的其它组分。如果需要，组合物可以具有高密度的营养细胞或繁殖体，或营养细胞和繁殖体的混合物。
[0195]
有利地，可以定制组合物以在指定位置使用。在一个实施例中，微生物生长设施位于或靠近将使用基于微生物的产品的地点(例如，柑橘园)。
[0196]
有利地，这些微生物生长设施解决了当前依赖遥远的工业规模生产商的问题，这些生产商的产品质量由于上游加工延迟、供应链瓶颈、储存不当以及其它突发事件而受到影响，所述突发事件阻碍例如可行的、高细胞计数产品以及细胞最初生长的相关培养基和代谢物的及时交付和施用。
[0197]
微生物生长设施通过其定制基于微生物的产品的能力来提供制造多功能性，以提高与目的地地理的协同作用。有利地，在优选实施例中，本发明的系统利用天然存在的当地微生物和其代谢副产物的能力来改善农业生产。
[0198]
单个容器的培养时间可以是例如1至7天或更长。可以多种不同方式中的任一种来收获培育产品。
[0199]
例如，在发酵的24小时内进行当地生产和交付会产生纯的、高细胞密度的组合物，并显著降低运输成本。鉴于开发更有效和更强大的微生物接种剂的快速发展前景，消费者将从这种快速交付基于微生物的产品的能力中受益匪浅。
[0200]
实例
[0201]
从以下举例说明的实例中可以更好地理解本发明和其许多优点。以下实例说明了本发明的一些方法、应用、实施例和变体。其不应被认为是对本发明的限制。可对本发明进行许多改变和修改。
[0202]
实例1-使用深层发酵制备包含槐糖脂的组合物
[0203]
槐糖脂的混合物是通过在含有100g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、1g/l尿素、100ml/l芥花油的水溶液和0.01至0.5g/l微量元素的发酵培养基中发酵球拟假丝酵母合成的。发酵培养基的所有成分都是gras。发酵5-7天后，在发酵容器底部有约500g/l的槐糖脂沉淀为棕色层。
[0204]
收集槐糖脂层并稀释4倍至slp浓度为125g/l。slp不需要使用有毒溶剂(如乙酸乙酯)进行纯化，因为所得粗生物表面活性剂的每一种成分对于农业目的都是有益的或无害的。
[0205]
粗产品中slp的百分比为65％至90％，残余葡萄糖和脂肪酸的量微不足道。内酯型与酸性型slp的比例约为70:30。在cmc≤100ppm时，此类产品的表面张力降低≤35mn/m。可以使用氢氧化钠将ph调节至例如6.5-7.0。
[0206]
实例2-用于提高土壤润湿性、肥力、盐度和渗透压的slp
[0207]
土壤润湿性
[0208]
土壤疏水性导致水聚集在土壤表面而不是渗入地下。土壤拒水性可能是由于土壤颗粒上存在疏水涂层而引起的。例如，由于某些植物材料的燃烧产生的覆盖土壤颗粒的蜡质物质，野火会导致土壤拒水。这增加了拒水性、水和养分的径流以及燃烧后场地的侵蚀。
[0209]
在一个实施例中，用包含疏水性slp(例如，内酯slp和/或二乙酰化或单乙酰化酸性slp)的组合物处理疏水性土壤降低了疏水性土壤的拒水性，允许增加水向土壤中的渗透，并且使水分和养分更均匀地分散在土壤中。
[0210]
土壤肥力
[0211]
在一个实施例中，包含疏水性slp(例如，内酯slp和/或二乙酰化或单乙酰化酸性slp)的组合物可以增强植物根部从土壤中吸收养分(例如，npk、硼、氯、钴、铜、铁、锰、镁、钼、硫、锌、钙、镍、硅和钠)，从而促进植物生长和提高作物产量。此外，通过增加土壤的润湿性，还可以实现养分在整个土壤中的更均匀分散，从而增加植物根部的养分可用性。
[0212]
土壤盐度
[0213]
盐渍土不能通过化学改良剂、调节剂或肥料进行改造，而是通过从植物根区浸出盐分。在一个实施例中，包含疏水性slp(内酯slp和/或二乙酰化或单乙酰化酸性slp)的组合物增加了土壤中水的润湿性、分散性和渗透性。因此，随着时间的推移，组合物将盐分“推”到土壤内和根际下方的更深处，从而使靠近地表的土壤层可用于农业目的。
[0214]
渗透压
[0215]
当不同离子或溶质浓度的溶液被半透膜隔开时，会产生渗透压。水和溶质分子的随机运动产生了水向具有较高溶质浓度的隔室的净运动，直到达到平衡。这种由浓度差异
引起的净运动称为扩散。
[0216]
当土壤水分含量低时，植物根部和地上部分组织液的渗透压会随着时间的推移而增加，导致营养生长速率降低，气孔开口改变，淀粉储备耗竭，表观光合作用减少，以及呼吸作用增加。
[0217]
在一个实施例中，包含疏水性slp(例如内酯slp和/或二乙酰化或单乙酰化酸性slp)的组合物增加了土壤中水的润湿性、分散性和渗透性。因此，随着时间的推移，植物组织的渗透压将降低和/或接近平衡，这使植物能够生长得更快以及更大，并且在某些情况下，超过其它侵入性或杂草植物。
[0218]
实例3-用于害虫防治的slp
[0219]
slp可以具有很强的抗细菌、抗真菌和/或抗病毒能力。在一个实施例中，生物杀虫剂活性的有效slp浓度为0.009至10mg/l，但在大多数情况下不超过3mg/l。
[0220]
slp对以下各者有效：许多细菌植物病原体，例如胡萝卜软腐食酸菌(acidovorax carotovorum)、解淀粉欧文氏菌(erwinia amylovora)、菊苣假单胞菌(pseudomonas cichorii)、丁香假单胞菌(pseudomonas syringae)、胡萝卜软腐果胶杆菌(pectobacterium carotovorum)、青枯雷尔氏菌(ralstonia solanacearum)、叶缘焦枯病菌(xylella fastidiosa)和野油菜黄单胞菌(xanthomonas campestris)；
[0221]
真菌植物病原体，例如链格孢属、曲霉属、镰刀菌属、青霉属、青霉属、酵母属、枝孢属、粘褶菌属和裂褶菌属、驼孢锈菌属(例如，咖啡驼孢锈菌(h.vastatrix))、灰葡萄孢菌(botrytis cineria)和疫霉属；
[0222]
一些植物病毒，例如疱疹病毒；以及一些线虫。
[0223]
在一个实施例中，组合物包含内酯slp。内酯slp可用于细胞壁的裂解，从而使组合物有利于抗细菌和抗真菌应用。
[0224]
在一个实施例中，组合物包含酸性slp，其更利于抗病毒应用。
[0225]
在一个实施例中，组合物包含约70％的内酯slp和30％的线性slp，提供针对多种植物病原体，包括细菌、真菌、病毒和线虫的有效性。
[0226]
实例4-使用固态发酵制备包含鼠李糖脂的组合物
[0227]
通过深层培养铜绿假单胞菌(其为一种机会性病原体)已显示出鼠李糖脂(rlp)的最高积累。铜绿假单胞菌的致病性也限制了rlp的产生，因为工人有暴露于微生物的风险。
[0228]
在某些实施例中，本发明利用非致病性细菌泰国伯克氏菌来产生rlp。使用固态或基质发酵方法，其中玉米麸皮用作固体底物。甘油、酵母提取物、马铃薯葡萄糖和一些少量的微量元素与玉米麸皮混合。
[0229]
底物用泰国伯克氏菌接种，培养7至8天，且任选地干燥。这将产生大约20至30g rlp/千克干燥培养物/底物。
[0230]
有利地，除了干燥和灭活细菌细胞，所述方法不需要任何额外的提取或纯化步骤，因为在一些实施例中，包含玉米麸皮、伯克氏菌细胞和rlp的所得物质比单独的rlp对土壤和植物更有益。在某些实施例中，这是由于玉米麸皮中存在的维生素、氨基酸、蛋白质和矿物质(例如，甜菜碱、胆碱、叶酸盐、叶酸、烟酸、核黄素、维生素a、胡萝卜素、维生素b、维生素k、钙、铜、铁、锰、镁、磷、硒、钾、锌等；以及灭活细菌细胞中存在的养分(例如，有机氮、碳、硫、磷、钾、铜、镁等)。
[0231]
实例5-用于提高土壤肥力的rlp
[0232]
存在于土壤和肥料化合物中的锌、铜、铁、锰和其它微量元素通常很难被植物根部吸收。虽然使用螯合剂(如乙二胺四乙酸(edta)和二亚乙基三胺五乙酸(dtpa))通常用于增加土壤中微量元素的持久性，但金属-edta和dtpa复合物不易被植物根部吸收，这限制了肥料功效。
[0233]
在一个实施例中，包含rlp的组合物可以通过促进植物根部吸收土壤中的锌和其它微量元素来帮助提高土壤肥力。在一个实施例中，rlp与锌、铜、铁和/或锰形成亲脂性复合物，这可以提高这些微量元素对植物根部的生物可用性。
[0234]
实例6-用于去除土壤污染物的rlp
[0235]
有机和无机污染物的存在会影响农田的生产力，所述污染物会给作物带来非生物胁迫。
[0236]
在一个实施例中，包含按体积计0.05％至0.5％或约0.1％rlp的组合物通过充当螯合剂来增强从土壤中去除砷和/或重金属污染物，所述螯合剂可与这些材料形成复合物并促进它们从植物根区土壤层释放和/或排放。因此，可以这种方式处理受污染的土壤，以使土地可用于农业目的。
[0237]
实例7-用于害虫防治的rlp
[0238]
在一个实施例中，包含约0.04至35mg/l、或0.1至25mg/l、或0.5至15mg/l rlp的组合物可以两种方式适用于害虫防治。
[0239]
首先，在一些实施例中，由于rlp的杀虫特性，所述组合物可以对害虫产生直接作用。鼠李糖脂对以下各者有活性：细菌，包括例如铜绿假单胞菌、产气肠杆菌(enterobacter aerogenes)、粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)、肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumonia)、微球菌属、链球菌属、葡萄球菌属和芽孢杆菌属、木杆菌属；以及某些真菌，包括例如葡萄孢属(例如灰葡萄孢菌)、丝核菌属、腐霉属、疫霉属和轴霜霉属、米黑毛霉(mucor miehei)和粗糙脉孢菌(neurospora crassa)。
[0240]
鼠李糖脂对某些节肢动物也有活性，例如埃及伊蚊幼虫、桃蚜(green peach aphid/myzus persicae)、蛛形纲、蚱蜢和槭姬缘蝽。
[0241]
其次，包含rlp的组合物还可以对害虫防治具有间接作用，其中rlp有助于调节植物的免疫系统以引发防御反应并诱导对害虫(例如半活体营养细菌)以及其它生物和/或非生物压力源的抗病性。
[0242]
实例8-使用固态发酵制备包含甘露糖基赤藓糖醇脂的组合物
[0243]
在一个实施例中，mel是使用蚜虫拟酵母在固态反应器中产生的。固体底物包含大豆、酵母提取物、赤藓糖醇和一些微量元素的混合物。
[0244]
在固态反应器中达到所需的细胞计数和/或代谢物浓度后，将整个培养物干燥以产生包含mel、底物和灭活的拟酵母细胞的产品。此产品比单独的mel对土壤和植物更有益，因为大豆和灭活酵母细胞都是养分，例如有机氮、磷和钾的良好来源。
[0245]
实例9-用于害虫防治的mel
[0246]
鉴于mel的广泛杀虫活性，包含mel的组合物有利于害虫防治。在某些实施例中，mel可用于防治以下微生物害虫：
[0247]
大豆和/或油菜，包括例如大豆疫霉根腐病、菜豆壳球孢菌、立枯丝核菌，核盘菌、
镰刀菌属(例如尖孢镰刀菌、半裸镰刀菌、粉红镰刀菌、茄病镰刀菌)、间座壳属(例如菜豆间座壳(d.phaseolorum var.sojae)(大豆拟茎点菌(phomopsis sojae))、大豆北方茎溃疡病菌(d.phaseolorum var.caulivora))、链格孢菌属(例如甘蓝链格孢菌(a.bassicae)、交链格孢菌(a.alternate))、齐整小核菌(sclerotium rolfsii)、尾孢菌属(例如菊池尾孢菌(c.kikuchii)、大豆尾孢菌(c.sojina))、腐霉属(例如瓜果腐霉(p.aphanidermatum)、终极腐霉(p.ultimum)、德巴利腐霉(p.debaryanum))、霜霉属(例如东北霜霉(p.manshurica)、寄生霜霉(p.parasitica))、黑线炭疽菌(colletotrichum dematium)(平头炭疽菌(c.truncatum))、多主棒孢菌(corynespora cassiicola)、斑枯病(septoria glycines)、灰星病(phyllosticta sojicola)、丁香假单胞菌p.v.大豆、野油菜黄单胞菌p.v.菜豆、大豆白粉菌(microsphaera diffusa)、大豆茎褐腐病菌(phialophora gregata)，大豆丛殻菌(glomerella glycines)、大豆层锈菌(phakopsora pachyrhizi)、大豆孢囊线虫油菜茎基溃疡病菌(heterodera glycines leptosphaeria maculans)、芸苔生球腔菌(mycosphaerella brasiccola)、白锈菌、大豆花叶病毒，烟草环斑病毒，烟草条纹病毒和番茄斑枯病病毒；
[0248]
苜蓿，包括例如苜蓿萎蔫病菌(clavibacter michiganensis subsp.insidiosum)、腐霉属(例如终极腐霉、畸雌腐霉、华丽腐霉、德巴利腐霉、瓜果腐霉)、大豆疫病、车轴草霜霉(peronospora trifoliorum)、苜蓿茎点霉菌(phoma medicaginis var.medicaginis)、苜蓿尾孢、苜蓿假盘菌、苜蓿黄斑病菌(leptotrochila medicaginis)、镰刀菌属、野油菜黄单胞菌p.v.苜蓿、根腐丝囊霉和匍柄霉属(例如，草色匍柄霉(s.herbarum)、苜蓿匍柄霉(s.alfalfa))；
[0249]
小麦，包括例如假单胞菌属(例如，丁香假单胞菌p.v.生黑、丁香假单胞菌p.v.丁香)、冰草条黑粉菌、野油菜黄单胞菌p.v.半透明、交链格孢菌、多主枝孢、镰刀菌属(例如禾谷镰刀菌、燕麦镰刀菌、黄色镰刀菌)、小麦壳二孢、麦类条斑病菌、禾本科炭疽刺盘孢菌、禾本科白粉菌fsp.小麦，锈菌属(例如小麦叶锈菌fsp.小麦、小麦条锈菌、小麦秆锈菌fsp.小麦)、偃麦草核腔菌、壳针孢属(例如颖枯壳针孢、小麦壳针孢、燕麦壳针孢)、小麦基腐病菌、丝核菌属(例如立枯丝核菌、禾谷丝核菌)、小麦全蚀病菌var.小麦，腐霉属(例如，瓜果腐霉、强雄腐霉、终极腐霉、强雄腐霉、禾生腐霉、瓜果腐霉)、麦根腐平脐蠕孢、麦角菌、腥黑粉菌属(例如，小麦腥黑粉菌(t.tritici)、光滑腥黑粉菌(t.laevis)、印度腥黑粉菌(t.indica))、小麦散黑粉菌、大麦黄矮病毒、雀麦花叶病毒、土壤传播的小麦花叶病毒、小麦条纹花叶病毒、小麦纺锤线病毒、美国小麦条纹病毒、高平原病毒和欧洲小麦条纹病毒；
[0250]
向日葵，包括例如霍尔斯单轴霉(plasmophora halstedii)、核盘菌、向日葵壳针孢、向日葵茎溃疡病菌、链格孢菌属(例如向日葵链格孢菌、百日草链格孢菌)、灰葡萄孢菌、向日葵黑茎病菌、菜豆壳球孢菌、菊科白粉菌、根霉属(例如米根霉、少根根霉、匍枝根霉)、向日葵条锈菌、大丽轮枝菌、胡萝卜软腐欧文氏菌p.v.胡萝卜、顶头孢霉、隐地疫霉、婆罗门参白锈菌(albugo tragopogonis)和翠菊黄化(aster yellows)；
[0251]
玉米，包括例如镰刀菌属(例如，串珠镰刀菌var.亚黏团、轮枝镰刀菌、串珠镰刀菌、玉米赤霉(禾谷镰刀菌))、玉蜀黍狭壳柱孢(stenocarpella maydis)(玉蜀黍壳色单隔孢菌)、腐霉属(例如畸雌腐霉、德巴利腐霉、禾生腐霉、华丽腐霉、终极腐霉、瓜果腐霉)、黄曲霉、玉米小斑病菌o,t(异旋孢腔菌)、长蠕孢属(例如，炭色长蠕孢(h.carbonum)i、ii和
iii(炭色孢腔菌)、柄长蠕孢(h.pedicellatum))、玉米大斑病菌(exserohilum turcicum)i、ii和iii、玉蜀黍节壶菌、玉米黄叶枯病菌、玉米球梗孢(kabatiella maydis)、玉米弯苞叶斑病菌、玉米黑粉菌、柄锈菌属(例如玉米柄锈菌、多堆柄锈菌)、菜豆壳球孢菌、草酸青霉、稻黑孢霉、多主枝孢、弯孢霉属(例如新月弯孢霉、不等弯孢霉、苍白弯孢霉)、密执安棒形杆菌内布拉斯加州亚种(clavibacter michiganense subsp.nebraskense)、绿色木霉、玉米麦角菌(claviceps sorghi)、燕麦假单胞菌、欧文氏菌属(例如胡萝卜软腐欧文氏菌、玉米细菌性枯萎欧文氏菌、菊欧文氏菌pv.玉蜀黍)、大孢色二孢、大孢指疫霉、指霜霉属(例如玉蜀黍指霜霉、菲律宾指霜霉、玉米指霜霉、甘蔗指霜霉)、丝孢堆黑粉菌、玉米被痂锈菌(physopella zeae)、头孢霉属(例如玉米头孢霉、顶头孢霉)、玉米矮花叶病毒a和b、小麦条纹花叶病毒、玉米褪绿矮缩病毒、玉米矮化螺原体、玉米褪绿斑驳病毒、高原病毒、玉米花叶病毒、玉米雷亚多非纳病毒(maize rayado fino virus)、玉米条纹病毒、玉米条纹病毒和玉米粗矮病毒；
[0252]
高粱，包括例如玉米大斑病菌、禾谷炭疽病菌(禾本科炭疽刺盘孢菌)、高粱尾孢菌、高粱胶尾孢菌、高粱囊二孢菌、假单胞菌属(例如燕麦假单胞菌(p.alboprecipitans)、丁香假单胞菌p.v.丁香、須芝草假單胞菌)、野油菜黄单胞菌栖绒毛草致病变种(xanthomonas campestris p.v.holcicola)、紫柄锈菌、菜豆壳球孢、拳须黑团孢、镰刀菌属(例如串珠镰刀菌、禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌)、交链格孢菌、高粱平脐蠕孢菌、高粱长蠕孢菌、新月弯孢霉、高粱茎点霉、座枝孢属(例如高粱座枝孢(r.sorghi)、高粱座枝孢(r.sorghicola))、甘蔗黑痣菌、孢堆黑粉菌属(例如丝孢堆黑粉菌(丝黑穗病菌)、高粱坚轴黑粉菌)、高粱散黑穗病、高粱麦角菌、立枯丝核菌、直立顶孢霉、大孢指疫霉、指霜霉属(玉蜀黍指霜霉、菲律宾指霜霉)、禾生指梗霉、腐霉属(强雄腐霉(p.arrhenomanes)、禾生腐霉)、甘蔗花叶病毒h和玉米矮花叶病毒a和b；
[0253]
以及水稻，包括例如稻瘟病菌和立枯丝核菌。
[0254]
在某些实施例中，包含mel的组合物可用于控制线虫害虫，包括例如鳞球茎茎线虫、菊花滑刃线虫、异皮线虫属(例如车轴草异皮线虫、甜菜异皮线虫)、美洲剑线虫，短体线虫属(例如伤残短体线虫(p.vulnus)、落选短体线虫(p.neglectus)、穿刺短体线虫(p.penetrans)、钩状短体线虫(p.hamatus))、长针线虫属、肾状线虫属、根结线虫属(例如花生根结线虫(m.arearia)、奇特伍德根结线虫(m.chitwoodi)、北方根结线虫(m.hapla)、南方根结线虫(m.incognita)、爪哇根结线虫(m.javanica))、螺旋线虫属、拟毛刺属、矮化线虫属(例如半穿刺矮化线虫(t.semipenetrans))、长尾刺线虫(belonolaimus longicaudatus)和薄叶小环线虫(criconemella xenoplax)，
[0255]
在某些实施例中，包含mel的组合物可用于控制节肢动物害虫，包括例如，叶甲属(acalymma)、花园玫瑰卷叶蛾(acleris variegana)、非洲粘虫、非洲化蜜蜂、潜蝇科、布朗夜蛾(agrotis munda)、变异夜蛾(agrotis porphyricollis)、吴刺粉虱(aleurocanthus woglumi)、甘蓝粉虱(aleyrodes proletella)、南瓜缘蝽(anasa tristis)、奥地利丽金龟(anisoplia austriaca)、苹果开花象鼻虫(anthonomus pomorum)、草莓花象(anthonomus signatus)、红圆蚁(aonidiella aurantii)、蚜虫、甜菜蚜(aphis fabae)、棉蚜(aphis gossypii)、苹实蝇(apple maggot)、阿根廷蚁(argentine ant)、行军切叶虫(army cutworm)、山龙眼蛾(arotrophora arcuatalis)、咖啡链蚁(asterolecanium coffeae)、澳
大利亚灾蝗、马铃薯木虱(bactericera cockerelli)、番石植实蝇(bactrocera correcta)、荷蝽(bagrada hilaris)、胡桃天牛(banded hickory borer)、班克木钻孔蛾(banksia boring moth)、甜菜夜蛾、亚澳白裙夜蛾(bogong moth)、棉铃象虫(boll weevil)、甘蓝蚜(brevicoryne brassicae)、褐飞蝗、棕色大理石纹蝽、稻褐飞虱、小菜蛾、菜粉蝶幼虫、四纹豆象(callosobruchus maculatus)、甘蔗甲虫、胡萝卜茎蝇、瘿蚊科(cecidomyiidae)、地中海实蝇(ceratitis capitata)、黑角负泥虫、大麦条足秆蝇(chlorops pumilionis)、柑橘长角虫、咖啡绿软蚁(coccus viridis)、苹果蠹蛾、咖啡虎天牛甲虫、马铃薯甲虫、杂拟谷盗(confused flour beetle)、草螟属(crambus)、黄瓜叶甲(cucumber beetle)、象鼻虫(curculio nucum)、切根虫、小地老虎(dark sword-grass)、枣核甲虫、种蝇(属)、葱地种蝇(delia antique)、萝卜地种蝇(delia floralis)、甘蓝地种蝇(delia radicum)、沙漠蝗、根萤叶甲属(diabrotica)、小菜蛾(diamondback moth)、瓜绢野螟(diaphania indica)、黄瓜绢野螟(diaphania nitidalis)、柑桔木虱(diaphorina citri)、蔗根非耳象(diaprepes abbreviates)、长额负蝗(differential grasshopper)、摩洛哥戟纹蝗(dociostaurus maroccanus)、日本斑翅果蝇(drosophila suzukii)、香蕉弄蝶(erionota thrax)、绵虫牙亚科(eriosoniatinae)、甘蔗飞虱(eumetopina flavipes)、欧洲玉米螟(european corn borer)、甘蓝菜蝽(eurydema oleracea)、麦扁盾蝽(eurygaster integriceps)、森林红蝽、西花蓟马(frankliniella occidentalis)、东花蓟马(fankliniella tritid)、大蜡螟(galleria mellonella)、黑切根虫(garden dart)、温室粉虱、东方蝼蛄(gryllotalpa orientalis)、北方田蟋(gryllus pennsylvanicus)、舞毒蛾(gpsy moth)、棉铃虫(helicoverpa armigera)、谷实夜蛾(helicoverpa zea)、茄二十八星瓢虫(henosepilachna vigintioctopunctata)、小麦癭蚊、日本丽金龟、谷斑皮蠢、亮灰蝶(lampides boeticus)、潜叶虫、七星瓢虫(lepidiota consobrina)、榆蛎盾蚧(lepidosaphes ulmi)、叶足啄缘蝽(leptoglossus zonatus)、草地盲蝽(leptopterna dolabrata)、小蜡螟(lesser wax moth)、银潜蛾属(leucoptera)(蛾)、咖啡小扇潜蛾(leucoptera caffeine)、苹褐卷叶蛾、稻水象(lissorhoptrus oryzophilus)、长尾弄蝶、草盲蝽、桑粉介壳虫(maconellicoccus hirsutus)、蔷薇鳃角金龟(macrodactylus subspinosus)、马铃薯长管蚜(macrosiphum euphorbiae)、玉米象、烟草天蛾(manduca sexta)、大麦杆癭蚊(mayetiola hordei)、水蜡虫、葱谷蛾、桃蚜(myzus persicae)、稻绿蝽(nezara viridula)、油橄榄实蝇、禾蝇科(opomyzidae)、非洲达摩凤蝶(papilio demodocus)、木瓜粉蚁(paracoccus marginatus)、叶状虫胶介壳虫(paratachardea pseudolobata)、豌豆蚜、盾蝽总科(pentatomoidea)、马铃薯块茎蛾(phthorimaea operculella)、鳃角金龟(phyllophaga)(属)、葡萄根瘤蚜(phylloxera)、根瘤蚜总科(phylloxeroidea)、棉红铃虫(pink bollworm)、小卷叶蛾(platynota idaeusalis)、梅象(plum curculio)、暗色粉蚁(pseudococcus viburni)、紫斑谷螟(pyralis farinalis)、红火蚁(red imported fire ant)、红翅蝗、樱桃实蝇(rhagoletis cerasi)、西部樱桃实蝇(rhagoletis indifferens)、蓝橘绕实蝇(rhagoletis mendax)、红棕象甲(rhynchophorus ferrugineus)、谷蠹(rhyzopertha dominica)、米蛾、俄罗斯小麦蚜虫、梨圆蚧、介壳虫、眼蕈蚊科(sciaridae)、茶黄蓟马(scirtothripsdorsalis)、盾蝽科、菜斑潜蝇、银叶粉虱、小蜂房甲虫、大豆蚜(soybean aphid)、深斑柳蛾(spodopteracilium)、斜纹夜蛾
(spodopteralitura)、十一星瓜叶甲、南瓜藤透翅蛾、二斑姬缘蝽(stenotusbinotatus)、胸喙亚目(sternorrhyncha)、红向日葵种子象鼻虫(strauzia longipennis)、黄宽条跳甲、麦扁盾蝽(sunn pest)、甘薯褐黄缘蝽(sweet potato bug)、牧草盲蝽(tarnished plant bug)、南黄蓟马(thrips palmi)、褐色橘蚜(toxoptera citricida)、非洲木虱(trioza erytreae)、番茄斑潜蝇(tuta absoluta)、小圆皮蠹、黄星小灰蝶(virachola isocrates)、蜡虫(waxworm)、西方玉米根虫(western corn root worm)、小麦象鼻虫(wheat weevil)、冬尺蠖(winter moth)以及红湾鳄梨材小蠹(xyleborus glabratus)。
[0256]
实例10-使用深层共培养制备包含脂肽的组合物
[0257]
在一个实施例中，包含脂肽(例如，表面活性素)的组合物是使用解淀粉芽孢杆菌和黄色粘球菌的共培养产生的。当一起生长时，所述物种会试图相互抑制，从而产生大量具有强大抗细菌特性的脂肽。
[0258]
解淀粉芽孢杆菌接种物在小型反应器中生长24至48小时。黄色粘球菌接种物在2l工作体积的种子培养瓶中生长48至120小时。用这两种接种物接种发酵反应器。营养培养基包含：
[0259][0260][0261]
细粒颗粒锚定载体悬浮在营养培养基中。载体包含纤维素(1.0至5.0g/l)和/或玉米粉(1.0至8.0g/l)。
[0262]
这两种细菌在液体发酵培养基中产生脂肽。然后将发酵后的培养液干燥以去除多余的水并使细菌细胞失活。此产品包含营养培养基、细胞和脂肽，比单独的脂肽对土壤和植物更有益，因为灭活的酵母细胞是养分，例如有机氮、磷和钾的良好来源。
[0263]
实例11-用于害虫防治的脂肽
[0264]
表面活性素能够在低至0.005％的浓度下将水的表面张力从72降低至27mn/m。表面活性素具有很强的抗细菌(包括抗生物膜)、抗病毒和抗支原体活性，但抗真菌活性较低。
[0265]
伊枯草菌素是一类对多种致病性酵母菌和真菌具有抗真菌活性的成孔脂肽。伊枯
草菌素可以通过形成离子传导孔来增加微生物膜细胞的通透性。抗真菌活性与伊枯草菌素脂肽与靶细胞的细胞质膜的相互作用有关，并且靶细胞的k+通透性大大增加。
[0266]
丰原素也显示出很强的抗真菌活性并抑制多种植物病原体的生长，特别是丝状真菌。
[0267]
包含一种或多种这些脂肽的组合物可以抑制例如灰葡萄孢菌、核盘菌、胶孢炭疽菌、扁茎点霉属(phoma complanata)、镰刀菌属、曲霉属、麦根腐离蠕孢菌(biopolaris sorokiniana)、叶缘焦枯病菌和褐腐病菌属(例如，核果褐腐病菌(m.laxa)和桃褐腐病菌(m.fructicola))的生长。
[0268]
实例12-具有微生物细胞的生物表面活性剂
[0269]
有利地，根据本发明的包含微生物细胞培养物的组合物在存在植物、人和动物的情况下是安全的。灭活的微生物细胞可能含有高浓度的蛋白质、rna、脂质、氨基酸、维生素、矿物质和微量元素。
[0270]
优选地，用于生产根据本发明的微生物培养物的底物都是食品级的安全产品。在完成发酵循环后，可将含有所产生的生物表面活性剂、微生物细胞和残留培养液和/或固体底物的所得组合物干燥以蒸发过量的水并使细胞灭活。所得干燥物质可用作最终农产品和/或与其它干燥微生物培养物混合。
[0271]
在一个示例性实施例中，球拟假丝酵母细胞可以是氮、磷和钾的来源，氮、磷和钾是有价值的植物养分。此外，酵母在培养过程中可以富集铁、铜和锌等金属，从而在施用于土壤时为植物提供这些养分的来源。
[0272]
在一个实施例中，包含球拟假丝酵母细胞(无论是活的还是无活性的)的组合物可以增加植物根部对土壤养分的吸收，从而导致根和芽大小的增加。此外，在一个实施例中，包含球拟假丝酵母水解产物的组合物可以帮助预防除了在培养物中存在抗细菌和/或抗真菌生物表面活性剂和其它代谢物以外，由于例如增强和/或激活植物的天然防御机制而引起的细菌和/或真菌疾病。
[0273]
实例13-减少温室气体
[0274]
存在三种主要的温室气体：二氧化碳、甲烷和一氧化二氮。在某些实施例中，本发明的方法和组合物有助于以减少这些和其它污染大气气体排放的方式增强农业实践。
[0275]
在一个实施例中，组合物用作化肥、除草剂、杀虫剂、熏蒸剂、杀真菌剂和生长刺激剂(其可用作排放大气温室气体的前体化合物)的替代品。
[0276]
在一个实施例中，本发明方法的组合物和方法减少了大气中的二氧化碳。生物表面活性剂作为生长促进剂，可以增加植物的根和芽的大小。因此，更健康并且更健壮的植物充当碳汇，在光合作用过程中固定碳，并将多余的碳作为生物质储存。
[0277]
在一个实施例中，这些方法减少了甲烷排放。甲烷是由反刍家畜消化系统中的产甲烷古菌和细菌产生的。根据本发明的组合物，当施用于放牧牧场和/或牲畜饲料且接着被动物摄取时，可以减少动物消化道中产甲烷生物的量，从而减少甲烷产生。
[0278]
在一个实施例中，这些方法减少一氧化二氮的排放。大气中约60％的一氧化二氮是由利用硝酸盐和亚硝酸盐基肥料的农业实践产生的，所述肥料转化为一氧化二氮。根据本发明的组合物在用作矿物肥料的替代品时可以因此减少农业生产的一氧化二氮的量。
[0279]
实例14-固态“基质”发酵
[0280]
一种培养微生物和/或产生微生物生长副产物的方法可包含：将一层与水和任选的养分混合以促进微生物生长的固体底物铺展到托盘上以形成基质；将微生物的接种剂施加到基质的表面上；将接种过的托盘放入发酵反应器中；使空气通过反应器以将温度稳定在25-40℃之间；并允许微生物在整个基质中繁殖。
[0281]
在优选的实施例中，根据本发明方法的基质底物包含食品。食品可包括例如大米、豆类或荚果、扁豆、藜麦、亚麻籽、奇亚籽、玉米、其它谷物、面食、麦麸、面粉或粗粉(例如，玉米粉、碱化玉米粉、部分水解的玉米粉)，和/或其它类似的食品，以提供微生物培养物生长和/或赖以生存的表面区域。
[0282]
在一个实施例中，培养方法包含准备托盘，所述托盘可以是例如适合标准发酵烘箱的金属板盘或蒸汽盘。在一些实施例中，“托盘”可以是能够容纳底物和培养物的任何器皿或容器，例如由例如塑料、金属或玻璃材料制成的烧瓶、杯子、桶、板、盘、罐、筒、碟或柱。
[0283]
制备可包含用例如箔覆盖托盘的内表面。制备还可以包含通过例如高压灭菌对托盘进行灭菌。
[0284]
接下来，通过混合食品、水和任选的另外的盐和/或养分以支持微生物生长来制备基质底物。
[0285]
然后将混合物铺展到托盘上并分层以形成厚度约为1至12英寸，优选1至6英寸的基质。基质的厚度可以根据托盘或制备基质的其它容器的体积而变化。
[0286]
在优选的实施例中，基质底物提供了微生物可以在其上生长的充足的表面积，以及增强的供氧途径。因此，微生物生长和繁殖的底物也可以作为微生物的营养培养基。
[0287]
然后可以将接种的托盘放置在呈温度控制空间的形式的发酵反应器中。发酵参数可以根据要生产的所需产品(例如所需的微生物生物表面活性剂)和正在培养的微生物进行调整。
[0288]
反应器内的温度取决于所培养的微生物，但通常使用温度控制的空气循环将其保持在约25-40℃之间。循环空气还可以为培养物提供持续的氧合。空气循环还可以帮助将溶解氧保持在所需的水平，例如约90％的环境空气。
[0289]
可以将培养物培育允许微生物达到所需浓度的时间量，优选1天至14天，更优选2天至10天。
[0290]
在一些实施例中，微生物将在整个发酵过程中消耗部分或全部基质底物。