|
来源：生物世界 2023-10-20 09:36 该研究建立了猴痘病毒的快速精准的检测方法，通过crRNA的筛选建立了一套CRISPR检测体系，并联合等温扩增实现了猴痘病毒的快速、灵敏的精准检测。为猴痘病毒的快速诊断提供了有力的技术支持。 中国医学科学院病原生物学研究所郭斐课题组在 Cell Reports Methods 期刊发表了题为：Rapid and sensitive one-tube detection of mpox virus using RPA-coupled CRISPR-Cas12 assay 的研究论文。 该研究建立了一种快速精准的猴痘病毒检测方法，通过将等温扩增（RPA）与CRISPR-Cas12a的检测体系联合，可以实现猴痘病毒DNA在30分钟内的快速检测，检测灵敏度1个拷贝数，同时能够精准区分其他正痘病毒以及猴痘病毒，具有良好的实用价值。
研究团队首先设计了两个crRNA的检测体系池，其中一组靶向正痘病毒（包括痘苗病毒、天花、牛痘以及猴痘）的保守区D6R和E9L，可以检测所有的正痘病毒；另外一组靶向猴痘病毒特有的区域N3R和N4R。通过对crRNA的设计和筛选，建立了基于CRISPR/Cas12a的荧光报告体系（图1）。
图1：CRISPR-Cas12a检测体系的建立及crRNA的筛选
进一步针对选择的crRNA，分别检测不同拷贝数的质粒模板以及病毒DNA模板，观察到CRISPR-Cas12a单独检测体系的检测限约为108拷贝数，不同crRNA的联合可以将检测限提高到107拷贝数，同时实现了正痘病毒与猴痘病毒的区分。并且为了实现最低检测限，研究团队团队将等温扩增（RPA）与CRISPR-Cas12a的检测体系联合，最终能够达到1个拷贝的最低检测限，大大提高了检测体系的灵敏度（图2）。
图2：RPA联合CRISPR-Cas12a检测体系的实现1个拷贝的最低检测限 为了验证检测体系实际应用的可靠性与准确性，针对中国大陆第一例猴痘病例的拭子样本进行了检测。该体系同样实现了1个拷贝数的最低检测限，并且成功的在病人咽拭子，鼻拭子以及水泡拭子中检测到了猴痘病毒的DNA，证实了体系应用的可靠性。同时针对猴痘病毒核酸检测试剂国家参考品的检测，阴性参考品中未检测到猴痘病毒的DNA，进一步证实了检测体系的准确性（图3）。
图3：RPA联合CRISPR/Cas12a检测体系对临床样本的检测 最终为了提高检测效率，进一步优化反应体系到单管中，大大的缩短了检测时间以及操作步骤。在提取得到待测DNA后，15分钟到30分钟内即可实现样本的快速检测，且灵敏度高达1个拷贝数。相比于传统荧光PCR的2小时，大大缩短了检测时间，提高了检测的灵敏度（图4）。
图4：RPA联合CRISPR-Cas12a检测体系的优化
综上所述，该研究建立了猴痘病毒的快速精准的检测方法，通过crRNA的筛选建立了一套CRISPR检测体系，并联合等温扩增实现了猴痘病毒的快速、灵敏的精准检测。为猴痘病毒的快速诊断提供了有力的技术支持。 中国医学科学院病原生物学研究所助理研究员赵斐、博士生胡亚美、范张玲，中国疾病预防控制中心黄保英为论文共同第一作者。中国医学科学院病原生物学研究所郭斐研究员、中国疾病预防控制中心谭文杰研究员和中国医学科学院病原生物学研究所许丰雯副研究员为论文共同通讯作者，感谢合作者加拿大麦吉尔大学梁臣教授、北京同仁医院房居高教授、北艾斌教授的大力支持。该研究获得了中国医学科学院医学科技创新工程、科技部国家重点研发计划、国家自然科学基金等项目的资助。   |
|
|
