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01、蛋白微阵列技术 虽然高通量的转录组核酸阵列可以比蛋白微阵列覆盖更多的种类和数量，但是在细胞功能中起主要作用的是蛋白质，因此蛋白微阵列技术的发展有望成为获得更大的细胞功能尺度的新方法。蛋白微阵列技术被定义为：一种可以在单位区域内打印大量微小斑点并可以进行后续蛋白检测的技术。蛋白微阵列技术可以根据微阵列表面固定类型的不同进行如下分类： 固定某种蛋白，分析与其他蛋白的相互作用蛋白与蛋白的相互作用是发挥生物学功能最主要的机制之一，蛋白微阵列技术提供了一种高通量和特异性的方法。但蛋白与蛋白相互作用技术的输出大多定性的，因此，它们在蛋白质组时代扮演着“脚手架”信息的基本角色。但却产生越来越详细和可靠的生物模型。固定分析物(如样本)，分析与检测物(如抗体)的相互作用固定检测物，分析与分析物的相互作用蛋白微阵列的分析物一般是指样本，例如，来自结肠癌细胞系的细胞裂解液将作为分析物与检测物反应。检测物是对分析物有特异性结合的物质，能与分析物特异性结合的抗体、适配体、小分子等都是检测物。分析物和检测物无论是被固定在基底上还是自由处在溶液中，反应都能在固相基底表面进行，特异性结合信号都能被检测到。 d)(b)和(c)的组合 (b)和(c)的结合通常是指“捕获抗体-抗原-检测抗体”这样的双抗体夹心法ELISA(酶联免疫检测技术)。但是微阵列技术可以仅仅使用捕获抗体或检测抗体，而不需要ELISA那样的抗体对。
02、基于反相蛋白微阵列技术的蛋白组学定量分析 在目前已知的蛋白组学定量研究中，抗体是一个主要的影响因子。基于抗体的芯片可分为之前描述的b)、c)、d)三种类型，检测物一般是指抗体，分析物一般是指细胞裂解液等样本。 正相蛋白微阵列(Forward Phase ProteinmicroArray，FPPA)是先将多种抗体打印在固相基底上，然后检测细胞裂解液等样本中的蛋白。
反相蛋白阵列技术(Revers Phase ProteinmicroArray，RPPA)是将细胞裂解液等样本打印到固相基底上，然后用抗体检测样本中的蛋白。正好与正相蛋白微阵列技术相反。
RPPA技术流程：样本类型可以是微生物、细胞系或者人组织活检，需要经过裂解;抗体需要提前筛选过并确认过抗体的特异性，可以通过最简单的WB的方法，只有分子量正确且是单条带的才能被认为是好的抗体;打印基底一般是硝酸纤维素覆盖的玻片;打印仪一般是实心针的2470Arrayer;样本被打印到基底上后，特异性的一抗与目标蛋白结合，再使用含有特殊标记的二抗进行信号检测，采集到的图像经过软件的自动化处理后输出蛋白浓度信息。如下图所示。
最初这项技术是由George Mason大学的研究人员Emanuel Petricoin和Lance Liotta研发的，他们也是这项技术的主要使用者，目前有3台基于2470 Arrayer构建的RPPA平台。在Gordon Mills和Rehan Akbanie领导下，MD安德森癌症基因组中心专注于蛋白质组学分析，其使用反相蛋白微阵列(RPPA)技术来研究从各种NCI项目中获得的肿瘤组织，这些项目包括Exceptional Responders Initiative，ALCHEMIST精准医学实验，Cancer Driver Discovery项目，Cancer Trials Support Unit和癌症治疗评估项目。MD安德森拥有3台2470Arrayer构建的RPPA平台，运行超过了100000个样本，并建立了高质量的数据集，这些数据公众也能使用。
尽管RPPA技术需要特异性的抗体，但它能够检测多种维度下的大量样本的蛋白水平。但是，与抗体、重组蛋白溶液相比，蛋白混合物样本是非常粘稠的。除此之外，蛋白网络监测研究的样本需要在很多不同的时间点去收集。因此，样本收集能力和粘稠样本打印能力成为了RPPA技术的限制条件。 03、微阵列打印仪的发展 蛋白微阵列的制备离不开微阵列打印仪。目前微阵列打印仪根据针头的结构不同大致可分为3种，包括裂隙针、喷墨(压电)式、实心针。 裂隙针主要是在早期的双色DNA微阵列中发挥了主要作用。这个概念是基于通过两个检测颜色的比例消除打印差异或打印的非线性问题，打印质量并不是最佳的，并且打印针头的设计也是比较复杂的。许多微阵列研究往往涉及打印稀释曲线，理想情况下，梯度稀释曲线应与分析物浓度呈明显的线性关系。由于裂隙针内部储存一定量的样本，所以裂隙针时不适合一个斑点一根针这种打印方式的，而且裂隙内样本的不断减少所形成的容积变化导致了打印斑点的差异性。因此裂隙针的打印差异是不可能产生线性稀释曲线的，裂隙针这种斑点的打印结果还需要其他独立的技术来验证。
喷墨式是起源于墨水打印技术，它们在打印生物材料时性能良好。喷墨式是通过电脉冲来控制分配，产生一致性的斑点。然而，这种打印方式并不能很好的打印粘性样本，例如细胞裂解液或复杂混合物。此外，喷墨式的洗涤循环所需的时间是比较长的，并且对于含有非常多的样本的大规模的微阵列，喷墨式是不适合的。
实心针打印方式相对而言是简单的。针头从微孔板中沾取样本后将液滴沉积到打印基底表面，整个过程不涉及到其他的机械力。实心针微阵列最初是由GMS/Affymetrix 417的针环式打印的，实现方式是样本在环内形成一个半月形，实心针穿过这个半月形的样本进行打印。这种方式优势之处在于打印粘性样本，但是环内的样本残留一方面导致了样本的浪费，另一方面也加大了清洗的难度。另外也需要更高的打印通量和长时间打印时环境控制。
Quanterix(收购Aushon)公司的2470Arrayer是一款实心针接触式微阵列打印仪器。针的外壁和针尖表面经过了特殊的表面处理，当针沾取样品后，由于针的外壁非常的光滑，只会在针顶端形成一个微滴。针尖上的微滴由于受到基底表面更大的表面张力作用，当实心针轻触基底表面时，微滴便从针尖沉积到基底表面的指定位置上完成打印。
相比较于上述微阵列打印仪，基于实心针的2470 Arrayer具有以下优势： 针头结构简单，使用寿命久无空腔或管路的样本浪费，尤其适用于单样本单点打印无空腔容积变化影响，打印一致性高，可形成高密度打印针头清洗简单和充分与喷墨式相比，针头数量调整更灵活尤其适用于细胞&组织裂解液等粘性样本的打印 2470 Arrayer可同时支持100片玻片和30块384或1536孔样品板。2470在其严格的环境控制系统下，拥有极高的打印质量和多达30000个点的高密度微阵列。凭借其实心针的结构，2470比现有的任何一款仪器都要更适用于粘性样本的微阵列打印。 这些技术发展已经改变了从微阵列蛋白组学实验中所获得的信息的质量和数量。如图3所示。
04、定量检测的反相蛋白微阵列技术 实心针样式的2470Arrayer的出现，实现了微阵列打印的高质量和高密度。为了使得蛋白在室温下是变性的和可溶的，通常会使用了改进过的粘稠的PB裂解液(含6MUrea、43.6nMDTT、2.7%Chaps 、1.3%Pharmalyte、 pH 8-10.5)。基于2470Arrayer打印后的斑点的CV<1%，免疫染色信号CV<13%，从而保证了在反相蛋白阵列技术中的线性稀释要求。实际中，一个晚上2470可以打印50张玻片，每张玻片大于10000个点。微阵列的高通量使研究设计方案延伸到更多的维度。当使用针环打印方式时只能在一张玻片上打印几百个点，而使用实心针的2470可以在每张玻片上打印30000多个点。技术上来讲，可以在一张玻片上打印3000个样本(每个样本2倍稀释成10个梯度)。为了从稀释曲线中提取出所有的信息，通常使用剂量插值算法(DI25)，计算每条曲线大部分稳定区域的相对值(信号强度25%的范围)，这种算法用来评估不适合Logistic模型的曲线。RPPA技术大样本数量的潜力使得时间间隔和剂量梯度的定量蛋白网络监测成为了可能。
RPPA技术是从微小组织中检测多种蛋白的唯一方法。从手术切除的样本中获取的微解剖样本经过裂解后可以通过RPPA技术来发现特定疾病的生物标志物，但需要保证抗体的特异性。 RPPA最重要的一个应用是以定量方式监测蛋白网络信号动态。信号转导蛋白是处于连续的动态变化中，会因为输入类型、剂量、时间的变化而改变。尽管已经有通过标记蛋白在单细胞水平上追踪蛋白动态的报道，但是为了获得一个完整的网络动态，需要观察多种蛋白的变化，而RPPA技术可以通过抗体检测多种蛋白的动态变化，并且是同时和定量检测。 反相蛋白阵列(RPPA)代表了一种功能强大的功能性蛋白质组学方法，可以以经济有效、灵敏和高通量的方式在大量样本中定量检测几百种选定的蛋白。这种基于抗体的定量检测方法已被广泛用于肿瘤发生和进展的的分子机制的研究，并且发现生物标志物及其作用机制。目前MD安德森癌症中心的RPPA平台已经发布了458种针对特定蛋白的抗体，涵盖所有主要的癌症信号转导通路。 癌症蛋白质组图谱(The Cancer Proteome Atlas,TCPA)是一个侧重反相蛋白微阵列(RPPA)的网站(http://)。其中包含两个独立的数据库，第一个着眼于患者肿瘤的RPPA数据，其包含癌症基因组图谱中的32种癌症类型约8000个样本，另外约500个来自独立患者队列的样本。第二个应用侧重于癌细胞系的RPPA数据，包含19个谱系的>650个独立细胞系。许多这些细胞系都有公开的高质量DNA，RNA和药物筛选数据。 TCPA提供各种分析和可视化模块，帮助癌症研究人员以有效和直观的方式探索这些数据集。通过TCPA数据库能够分析RPPA蛋白与显著体细胞突变基因的相关性，评估拷贝数变化，DNA甲基化和mRNA对蛋白质的影响，能推断miRNA对蛋白质表达的调节作用，构建蛋白质与通路的共表达网络，并鉴定临床相关的蛋白质标志物。
05、RPPA抗体筛选的必要性 目前市场上有很多商业化的一抗，但一抗与抗原的特异性结合的真实性并不清楚。通常是通过跑电泳看下分子量是否正确，但这并不能完全确定抗体的特异性。严格的方法是当抗体结合抗原后，对抗原进行氨基酸测序，但这样不能获得与抗体结合的抗原表位信息。实际中，通常是通过WB实验观察抗体是否能在正确的分子量的位置与抗原结合形成单一的条带。
目前，MD安德森已经开发了458种适用于RPPA平台的抗体，可在其官网下载抗体筛选表格，表格中标注了抗体的采购来源、货号、属源、适用评分、使用稀释比、储存条件等，如上图所示。该抗体筛选表涵盖所有主要的癌症信号转导通路。 06、癌症的理论机制应用 研究学者已经在信号转导领域已经进行了广泛的肿瘤细胞的生化反应研究。不断累积的数据结果可以让研究者以理论方式设计反应模型，这已成为理解复杂生物系统的另一种方式。生化反应涉及到分子、细胞和环境之间高度复杂、非线性的相互作用。因此，基于理论方式建立的模型需要通过实验数据进行测试，以了解这些模型的实用性，完整性和价值程度如何。
理论生物学中的实验方法通常旨在识别系统的组分及其相互作用，并监测干扰对这些组分的影响。蛋白质在信号转导中起着重要作用，信号通路中最常见的过程便是蛋白质的磷酸化和去磷酸化。因此，定义复杂的信号通路需要定量的、实验性的、蛋白质组学的动力学数据。研究者们试图通过WB对数学模型和蛋白质表达动力学的结果进行比较，来模拟和预测蛋白质相互作用网络。然而，每次WB实验可以检测的样本数量和蛋白种类是不多的。为了验证数学模型的有效性，信号转导中的蛋白水平应该被描述为时间或其他变量的函数。与WB和单细胞技术相反，只要有合适的抗体，RPPA就可以检测大量样本中的多种蛋白质，包括磷酸化蛋白质。 Ramalingam等(2007)使用RPPA技术研究了p53-Mdm2反馈回路的数学模型。如下图所示。
07、抗癌药物靶标分子 大多数抗癌药物的作用机制尚不清楚。这在很大程度上是由于缺乏适当的可以监测药物应答的分子调控网络详细信息的模型和方法。
基于RPPA技术，已经有很多学者通过信号通路相关的抗体来分析肿瘤，并可扩展到其他任何细胞类型，对其中的目标蛋白进行检测。以往是通过常规WB或免疫组织化学方法对信号通路蛋白进行研究，而RPPA技术与这些方法相比较而言有以下几个优势：(1)每次实验仅需微量样本，(2)定量数据结果，(3)样本间严谨的对照，(4)多重蛋白检测能力。除此之外，很多学者已经使用了大量的肿瘤样本、临床样本或细胞系对通路蛋白进行了详细的研究。Paweletz等人(2001)首次通过RPPA技术描述了前列腺上皮细胞中的癌症进展，Akt信号通路激活(磷酸化的结果)抑制了细胞凋亡过程。Rudelius等人(2006)提示套细胞淋巴瘤中的 Akt活化可能是由于PTEN表达缺失所致，PI3K/Akt抑制剂可能是治疗套细胞淋巴瘤的有效药物。在过去的几年里，RPPA技术促进了研究研究人员对于癌症相关的信号通路中的蛋白质的研究。尽管由于异质性、蛋白稳定性和样本数量等问题导致肿瘤组织的分子靶向研究非常困难，但是对于患者样本中的真实信息的研究从未停止。RPPA技术允许每次实验仅使用少量体积的样本就可以进行大量样本的全面的多维蛋白质组学分析。基于对信号通路的了解，我们相信机体对于抗癌药物的应答绝不仅仅是一个分子的状态发生了改变。尽管抗癌药物是基于已经确定了分子靶点，但仍不清楚为什么会出现副作用、二次效应(如细胞周期停滞或细胞凋亡))，多少浓度的药物实际被传递(或当给药多种药物时，浓度的协同效应)。在实际中，如果没有合适的体外模型的话，很难推测患者的肿瘤中到底发生了什么。RPPA的优势在于通过这种坚实的理论方法可以提供丢失的信息。 08、结论 很明显，反相蛋白微阵列技术为我们提供了独特的机会从功能水平上理解癌症生物学。然而，蛋白质的生化状态取决于很多因素。通过详细监测和了解经过药物治疗的癌细胞内的分子相互作用，可以理解清楚一些重要问题，例如，为什么有些药物可以发挥作用而其他药物就不能。具有高通量和定量特性的反相蛋白微阵列技术将成为癌症研究的强有力的工具。虽然反相蛋白质阵列技术开展的要求比较高，但可以有效且高效的开展多维研究。虽然蛋白质组学分析为癌症研究提供了新的视角，但提出了技术上的挑战。最终，反相蛋白微阵列技术在癌症研究中的成功应用是跨学科汇集的结果，包括工程学、化学、数学、统计学、计算科学、生物学和医学。 参考资料： Spurrier，2008. Protein and lysate array technologiesin cancer research，Biotechnology Advances 26:361–369. https://www./home-research-index-rid-56999.shtml http://www.sohu.com/a/342762711_777125
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