【原】重组抗原Linker的选择及大肠杆菌偏好密码子

Linker起到一个分离的作用，将融合蛋白彼此分开些，不要彼此形成高级结构而影响功能的发挥。也就是说，为了防止或降低两个蛋白之间在空间构象上的相互干扰，设计融合蛋白时在两个蛋白之间添加一段连接肽。这种连接肽一般由侧链小的氨基酸组成。linker 不能太大，否则一是对结构有影响，二是增加了融合蛋白的抗原性。

大肠杆菌的偏好密码子序列在NCBI上可以查到，它与Linker的设计没有太大关系。设计Linker关键是选好氨基酸（侧链小的、柔韧性好的……），如果在E.coli表达的话最好使用E.coli的偏好性密码子，这样在翻译到Linker时才会顺利通过，不影响表达量、减少截短的表达产物。

可选甘氨酸做linker ，因为它是所有氨基酸中最小的，没有手性碳，所以柔性最好，放在融合蛋白之间不会影响两边蛋白的构象和功能发挥。本实验室多个重组抗原选用的是（GGGGS）作为基因片段间的Linker，效果不错，目的蛋白的抗原性和特异性均未受影响。根据大肠杆菌密码子偏好，GGGGS的碱基序列为ggc ggc ggc ggc agc。

Amino Preferred
acid   codon  % use
Ala  GCC  34
Arg  CGC  38
Asn  AAC  54
Asp  GAT  63
Cys  TGC  55
Gln  CAG  66
Glu  GAA  68
Gly  GGC  39
His  CAT  57
Ile  ATT  50
Leu  CTG  49
Lys  AAA  75
Met  ATG  100
Phe  TTT  57
Pro  CCG  51
Ser  AGC  26
Thr  ACC  42
Trp  TGG  100
Tyr  TAT  58
Val  GTG  36
Trm  TAA  62

出处：Comments to Todd D. Porter, Pharmaceutical Sciences, University of Kentucky College of Pharmacy, Lexington, KY 40536-0082. Phone [phone]; FAX [phone]
Last Modified: September 28, 2001
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氨酸： 甘氨酸 gly G；丝氨酸 Ser S；丙氨酸 gla A；苏氨酸 thr T；缬氨酸 val V；异亮氨酸 ile I；亮氨酸 leu L；酪氨酸 tyr Y；苯丙氨酸 phe F；组氨酸 his H；脯氨酸 pro P；天冬氨酸 asp D；甲硫氨酸 met M；谷氨酸 glu E；色氨酸 trp W；赖氨酸 lys K；半胱氨酸 cys C；精氨酸 arg R。

酰胺： 天冬酰胺 asn N；谷酰胺 gln Q。

常用Linker汇总如下表（我们实验室采用的是GGGGS，本表来源丁香园）

 

Linker选择要点

1、选glycine 做linker 因为它是所有氨基酸中最小的，没有手性碳，所以柔性最好，放在融合蛋白之间不会影响两边蛋白的构象和功能发挥。

2、linker 不能太大，否则一是对结构有影响，二是增加了融合蛋白的抗原性。
3、linker 呢，就是说它起到一个分离的作用，将融合蛋白彼此分开些，不要彼此形成高级结构而影响功能的发挥。也就是说，为了防止或降低两个蛋白之间在空间构象上的相互干扰，设计融合蛋白时在两个蛋白之间添加一段连接肽。这种连接肽一般由侧链小的氨基酸组成。两个连接肽的例子：1）(Gly)4即连续4个甘氨酸残基；2）Gly-Ser，组成一个BamHI位点ggatcc 一般3-5个glycine 比较合适。
4、linker链是一段柔性的链，有几种形式，如 GSGGSG ,GSGGSGG GSGGSGGG, GGGGSGGG,一般是用是用的（GGGGS）₃作Linker
5、有同行使用的是Invitrogen公司一个商业化的编码牛弹性蛋白的一段序列，其蛋白序列是：VPGVG VPGVG 。

6. linker需要是柔性的，最好是极性与非极性氨基酸相间隔的一小段α-螺旋。经验表明linker的长度不要超过12个氨基酸。

7. 选glycine 做linker 的原因是，它是所有氨基酸中最小的，没有手性碳，所以柔性最好，放在融合蛋白之间不会影响两边蛋白的构象和功能发挥，也就是空间位阻最小。另一个原则就是 linker 不能太大，否则一是对结构有影响，二是增加了融合蛋白的抗原性。如果这样为什么还要用 linker 呢，就是说它起到一个seperate 的作用，将融合蛋白彼此分开些，不要彼此形成高级结构而影响功能的发挥。一般3-5个glycine 比较合适。
8. 4个甘氨酸形成β转角

附.密码子对照表