【原】单抗抗体的筛选（Elisa法protocol）

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筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。

1. 材料和设备：

(1) 原辅材料：

待检样本、酶标板、酶标条、Na₂CO₃、NaHCO₃、NaCl、NaH₂PO₄·2H₂O、Na₂HPO₄·12H₂O、Tween-20、羊抗小鼠IgG、底物、硫酸、牛血清白蛋白。

(2) 用具及其他：

量筒、移液器、记号笔、巴氏管、塑料试管、胶帽、封口膜。

(3) 设备仪器：

滤器、电子天平、pH计、4℃冰箱、37℃水浴箱、酶标仪。

2. 操作步骤：

流程:物品准备→抗原准备→液体配制→酶标板包被→ELISA检测。

(1) 准备工作：

① PBS

NaCl 8.0 g、Na2HPO4 2.93 g、KCl 0.2 g、KH2PO4 0.2 g，定容至1L（pH7.2）。

② 洗涤液

500mLPBS+0.25mL Tween-20（终浓度0.05％）。

③ 包被液

无水Na2CO3 1.59 g，NaHCO32.93 g，定容至1L，pH9.6 。

④ 底物缓冲液

0.1M  C4H2O7·2H2O：29.41g溶于1L水。

0.2M  Na2HPO4·12H2O：71.62g溶于1L水。

25.7mL Na2HPO4 + 24.3mL C4H2O7 + 50mL 水配成100mL 底物缓冲液，

⑤ TMB液

10mg溶于5mL无水乙醇中，4℃保存。

⑥ 显色液

10mL底物缓冲液+0.5mLTMB液+2μL双氧水。

⑦ 二抗：用洗液稀释

     国产羊抗兔二抗1:1000稀释，进口羊抗小鼠二抗1:5000稀释。

⑧ 封闭液：2％BSA

     2gBSA溶于100mL洗涤液中，4℃保存。

⑨ 终止液。

  20 mL浓硫酸缓缓加入到80 mL蒸馏水中，至终浓度20%。

(2) 抗原准备

纯度＞90%的抗原，包被液稀释至1μg/mL。

(3)  ELISA步骤

① 包被液稀释抗原后，100μL/孔包被，4℃过夜或37℃2h。

② 洗板一次，每孔加入200μL封闭液。37℃2h。

③ 洗板三次，每孔加入100μL待检上清，37℃1h。

④ 洗板五次，每孔加入100μL羊抗小鼠二抗，1:5000或1:10000稀释，37℃1h。

⑤ 洗板五次，每孔加入100μL显色液，37℃ 5-10min。

⑥ 每孔加入50μL终止液。

⑦ 双波长450nm/630nm测值。