 导语 今天给同学们分享一篇非肿瘤+WGCNA+实验的生信文章“Growth differentiation factor 10 induces angiogenesis to promote wound healing in rats with diabetic foot ulcers by activating TGF-β1/Smad3 signaling pathway”，这篇文章于2023年1月13日发表在Scientific Reports期刊上，影响因子为5.2。  糖尿病足溃疡（DFU）是糖尿病（DM）的一种高发并发症。本研究旨在通过调节转化生长因子-beta 1（TGF-β1）/Smad3通路，确定生长分化因子10（GDF-10）在DFU伤口愈合中的作用。 1. WGCNA筛选出与糖尿病相关的五个基因共表达模块 糖尿病（DM）是一种高发的代谢性疾病，其特征是高血糖，控制不良会导致严重并发症，其中糖尿病足溃疡（DFU）是糖尿病患者最常见的慢性并发症之一（16）。在本研究中，作者采用了WGCNA算法分析DFU相关基因，并进一步进行功能富集分析以阐明核心基因的生物学功能。利用在线数据库构建了一个蛋白质相互作用网络（PPI network），以进一步研究核心基因在DFU中的作用机制。 首先，使用R软件包“WGCNA”构建了一个无标度共表达网络，识别了与DM相关的标记基因。选择了与DM相关的GSE29221微阵列进行聚类评估，该阵列包括12个对照样本和12个DM样本。为了测试样本的异常值，根据样本表达值的分布进行了层次聚类（图1A），分析中包含的样本略有不同。β = 20（无标度R 2 = 0.9）被视为建立无标度网络和基因表达网络的软阈值（图1B）。在DM表达谱中鉴定出了五个共表达模块，每种颜色代表一个不同的模块（图1C）。  图1 WGCNA识别与糖尿病相关的基因共表达模块 2. 聚类分析确定了与DFU相关的4417个候选基因 所有基因都通过它们之间的相关性进行评估和聚类，以获得个体模块之间的表达聚类分析图（图2A）。对每个模块基因与不同组的皮尔逊相关性进行了分析。获得了五个共表达模块用于后续分析（图2B），包括Meblue模块（包含621个基因），Mebrown模块（包含4417个基因），Megreen模块（包含156个基因），Meyellow模块（包含215个基因）和Megrey模块（包含877个基因）（图2C；附图1A-D）。模块特征相关性分析显示，Mebrown模块（包含4417个基因）与疾病最相关，相关系数为0.47。因此，棕色模块中的4417个基因被视为与DM相关的基因。  图2 筛选与糖尿病相关基因的关键共表达模块 3. 差异分析选择了与糖尿病足溃疡伤口愈合相关的175个差异表达基因（DEGs） 为了进一步筛选与DFU相关的关键基因，对GSE29221数据集进行了差异分析，共筛选出5338个差异表达基因（DEGs），其中2286个上调，3052个下调（图3A）。  图3 GEO差异分析用于筛选与DFU相关的差异表达基因（DEGs） 在对DFU相关的微阵列数据集GSE134431进行差异分析后，共获得5522个差异表达基因（DEGs），其中2961个基因上调，2561个基因下调（图3B）。 为了进一步筛选参与糖尿病足溃疡（DFU）的关键基因，对GSE134431微阵列数据集的差异表达基因（DEGs），GSE29221微阵列数据集的DEGs以及棕色模块基因进行了交集分析，得到了175个交集基因，用于后续的功能分析（图3C）。 4. TGF-β1/Smad3信号通路可能参与了糖尿病足溃疡的伤口愈合 受损皮肤血管生成减少被认为是糖尿病并发症中伤口愈合受损的关键原因之一。因此，使用GSEA数据库筛选了与血管生成相关的基因，共获得132个基因。采用STRING分析构建了血管生成和糖尿病足溃疡相关基因的蛋白相互作用网络图（图4A）。根据先前的研究，对候选基因调控的分子功能进行了深入探索，并进行了候选基因的GO功能分析和KEGG通路分析。  图4 DFU相关基因网络的构建和关键通路筛选 GO功能的结果表明，生物过程（BP）中的候选基因主要富集在免疫系统过程的负调控、免疫效应器过程的调控、内源性抗原的抗原处理和呼应干扰素-γ的细胞反应等生物过程中。此外，细胞组分（CC）中的候选基因主要富集在MHC蛋白复合物、含胶原的细胞外基质、内吞囊泡膜和内质网膜腔侧的整合组分等细胞组分中。此外，分子功能（MF）中的候选基因主要富集在糖胺聚糖结合、细胞外基质结构成分、肽抗原结合和肽结合等分子功能中（图4B）。 此外，KEGG通路分析结果显示，候选基因主要富集在RNA运输、1型糖尿病、TFG-β信号通路、膀胱癌、子宫内膜癌、长寿调节通路、TNF信号通路和炎症性肠病、孕激素介导的卵母细胞成熟、NF-kappa B信号通路、胆固醇代谢和肌醇磷酸代谢等方面（图4C）。在上述通路中，1型糖尿病和TGF-β信号通路占主导地位。 综上所述，上述研究结果表明候选基因在包括血管生成调控、细胞外基质组织、细胞外结构组织等生物过程中起着重要作用，并且这些候选基因在内质网腔、胶原三聚体和含胶原的细胞外基质中富集。 此外，KEGG分析结果显示，候选基因参与了RNA运输、1型糖尿病、TFG-β信号通路、TNF信号通路和NF-κB信号通路，其中TFG-β信号通路占主导地位。 5. GDF-10可能通过调节TGF-β1/Smad3信号通路参与糖尿病足溃疡的伤口愈合 使用PPI网络构建了DEGs与血管生成相关蛋白之间的相互作用网络，TGFBR3与更多蛋白相互作用（图5A）。TGFBR3代表一种第三型TGF-β超家族受体跨膜蛋白，通过调节TGF-β1/Smad3信号通路影响血管生成和迁移。对TGFBR3相关基因的进一步PPI分析显示，TGFBR3与GDF-10相互作用（图5B），而这两个基因在DFU中明显表达不足（图5C，D）。同时，BMP3B是TGF-β超家族的成员，也被称为GDF-10。现有证据表明，GDF-10可以促进成骨细胞的分化和生长。同时，GDF-10可以激活TGFBR1/Smad3/ERK通路，促进肿瘤细胞的生长和迁移，并进一步调节Smad家族转录因子的招募和激活。  图5 TGFBR3和GDF10之间的PPI关系 转化生长因子TGF-β1在糖尿病中的作用已经得到了很好的表征，并进一步激活了包括Smad2和Smad3在内的两个关键下游介质。同时，TGF-β也参与调节各种不同细胞类型（包括血管内皮细胞）的增殖、分化、迁移和存活。鉴于GDF-10是TGF-β家族的成员，作者推测GDF-10可能通过激活TGF-β1/Smad3信号通路来促进血管生成，从而促进糖尿病足溃疡的伤口愈合。 6. GDF-10刺激血管生成并促进了糖尿病足溃疡大鼠的伤口愈合 进一步研究GDF-10对DFU大鼠伤口愈合的影响，作者建立了DFU大鼠模型。DM大鼠的体重逐渐下降，而GDF-10治疗导致了相反的趋势。与接受GDF-10治疗的DM大鼠相比，接受GDF-10和Smad抑制剂SIS3治疗的DM大鼠的体重减少（图6A）。同时，空腹血糖结果显示DFU大鼠的血糖升高，而接受GDF-10治疗的DFU大鼠的血糖降低。与接受GDF-10治疗的DFU大鼠相比，接受GDF-10和SIS3治疗的DFU大鼠的血糖水平增加（图6B）。此外，伤口愈合面积结果显示，对照组大鼠伤口愈合更快，伤口周围的红肿在15天后消退。与对照组大鼠相比，DFU大鼠伤口愈合差，肉芽组织生长缓慢，呈深红色；伤口周围有更多的炎症渗出物，愈合面积减少。与DFU大鼠相比，接受GDF-10治疗的DFU大鼠伤口周围红肿明显减轻，没有明显渗出物，伴随着迅速增长的肉芽组织和愈合面积的增加，这些趋势可以通过进一步的SIS3治疗逆转（图6C）。  图6 GDF10刺激血管生成对DFU大鼠伤口愈合的影响 颗粒组织形成、胶原沉积、成纤维细胞增殖和血管生成被广泛采用作为创伤愈合的标志物。HE染色结果显示，对照组大鼠的炎症细胞较少，新生毛细血管也很少。与此同时，糖尿病足溃疡（DFU）大鼠表现出更多的中性粒细胞和淋巴细胞，但新生毛细血管很少。与接受GDF-10治疗的DFU大鼠相比，同时接受GDF-10和SIS3治疗的DFU大鼠显示出较少的成纤维细胞和新生毛细血管，以及更多的炎症细胞浸润（图6D）。进一步进行Masson三色染色以可视化组织中的胶原沉积，结果显示DFU大鼠中的胶原纤维较少。与接受GDF-10治疗的DFU大鼠相比，同时接受GDF-10和SIS3治疗的大鼠显示出较少的胶原纤维（图6E）。免疫荧光检测创伤新生血管，结果显示DFU大鼠相对于对照组大鼠的总血管和成熟血管减少。与接受GDF-10治疗的DFU大鼠相比，同时接受GDF-10和SIS3治疗的DFU大鼠显示出总血管和成熟血管减少（图6F）。 此外，RT-qPCR结果显示，在糖尿病足溃疡（DFU）大鼠中，Smad3、VEGF、Ang-1、TGF-β1、胶原蛋白I和胶原蛋白III的表达水平降低，而IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-9的表达水平增加。然而，在GDF-10治疗后，这些趋势发生了相反的变化。与仅接受GDF-10治疗相比，同时接受GDF-10和SIS3治疗的大鼠的Smad3、VEGF、Ang-1、TGF-β1、胶原蛋白I和胶原蛋白III的表达均减少，而IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-9的表达增加（图7A）。ELISA结果进一步显示，在DFU大鼠中，VEGF、Ang-1和TGF-β1的表达水平降低，而IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-9的表达水平增加。然而，在GDF-10治疗后，这些趋势发生了相反的变化。与接受GDF-10治疗的DFU大鼠相比，接受GDF-10和SIS3治疗的DFU大鼠的VEGF、Ang-1和TGF-β1的表达水平降低，而IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-9的表达水平增加（图7B）。  图7 GDF10刺激血管生成对DFU大鼠伤口愈合相关因子的影响 以上研究结果表明，GDF-10能够降低糖尿病大鼠的血糖、TNF-α、IL-1β和IL-6水平，并促进VEGF、TGF-β1和Ang-1的表达，通过激活TGF-β1/Smad3信号通路加速糖尿病足溃疡的愈合；然而，使用Smad抑制剂SIS3治疗后，治疗效果可以逆转。 总结 以上研究结果表明，GDF-10能够降低糖尿病大鼠的血糖、TNF-α、IL-1β和IL-6水平，并促进VEGF、TGF-β1和Ang-1的表达，通过激活TGF-β1/Smad3信号通路加速糖尿病足溃疡的愈合；然而，使用Smad抑制剂SIS3治疗后，治疗效果可以逆转。  图8 GDF10调节TGF-β1/smad3信号通路影响糖尿病足溃疡大鼠伤口愈合的分子机制图 |
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