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作者 陈旭1 吴宇财2 陈泽华1 黄健1 李学松2 林天歆1 作者单位 1中山大学孙逸仙纪念医院泌尿外科，广州 510120 2北京大学第一医院泌尿外科，北京 100034 引用本刊 陈旭，吴宇财，陈泽华，等. 尿液DNA甲基化在上尿路尿路上皮癌无创诊断中的应用价值[J].中华泌尿外科杂志，2023，44（10）：725-730. DOI:10.3760/cma.j.cn112330-20230904-00061. 通信作者 林天歆，Email：lintx@mail.sysu.edu.cn； 李学松，Email：pineneedle@sina.com  目的 探讨尿液DNA甲基化技术用于上尿路尿路上皮癌（UTUC）无创诊断的性能和价值。 方法 回顾性分析2019年8月至2021年3月中山大学孙逸仙纪念医院和北京大学第一医院收治的107例UTUC患者（UTUC组）和121例上尿路良性疾病患者（对照组）的病例资料。UTUC组男64例（59.8%），女43例（40.2%）；年龄（67±10）岁；输尿管癌50例（46.7%），肾盂癌42例（39.3%），肾盂癌合并输尿管癌15例（14.0%）；非肌层浸润性UTUC 45例（42.0%），肌层浸润性UTUC 51例（47.7%），分期不明确11例（10.3%）；肿瘤分级低级别14例（13.1%），高级别93例（86.9%）。对照组男81例（66.9%），女40例（33.1%）；年龄（52±14）岁；泌尿系结石104例（86.0%），输尿管狭窄或息肉13例（10.7%），单纯肾积水4例（3.3%）。UTUC组60例（56.1%）和对照组11例（9.1%）行尿脱落细胞学检查。UTUC组72例（67.3%）和对照组9例（7.4%）行尿液原位荧光杂交法（FISH）检查。对两组的尿沉渣样本行基于ONECUT2和VIM基因甲基化的定量PCR检测技术，≥1个基因阳性判定为阳性，2个均为阴性判定为阴性。以病理或临床诊断为标准，评估尿脱落细胞学、FISH、尿液DNA甲基化检查的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值、阴性预测值。 结果 尿液DNA甲基化检查的总体敏感性为84.1%，特异性为90.9%，准确性为87.7%，阳性预测值为89.1%，阴性预测值为86.6%；敏感性显著高于尿脱落细胞学（43.3%，P＜0.05）和FISH（69.4%，P＜0.05）；准确性明显高于尿脱落细胞学（52.1%，P＜0.05）和FISH（71.6%，P＜0.05）；特异性与尿脱落细胞学（100.0%）和FISH （88.9%）差异均无统计学意义（P＞0.05）。亚组分析结果显示，尿液DNA甲基化检查对不同部位肿瘤的诊断敏感性分别为输尿管癌74.0%（37/50例），肾盂癌90.5%（38/42例），肾盂癌合并输尿管癌100.0%（15/15例）；对不同良性疾病的诊断特异性分别为泌尿系结石92.3%（96/104例），输尿管狭窄和息肉84.6%（11/13例），单纯肾积水75.0%（3/4例）。尿液DNA甲基化检查对低级别UTUC的诊断敏感性为64.3%，明显高于尿脱落细胞学的20.0%和FISH的36.4%（P＜0.05）；对高级别UTUC的诊断敏感性为87.1%，高于尿脱落细胞学的48.0%和FISH的75.4%（P＜0.05）；对非肌层浸润性UTUC的诊断敏感性为77.8%，明显高于尿脱落细胞学的29.2%和FISH的64.5%（P＜0.05）；对肌层浸润性UTUC的诊断敏感性为88.2%，优于尿脱落细胞学的53.6%和FISH的72.7%（P＜0.05）。尿液DNA甲基化检查在中山大学孙逸仙纪念医院应用的敏感性和特异性分别为83.0%和92.0%，北京大学第一医院应用的敏感性和特异性分别为85.2%和85.7%。 结论 基于尿液ONECUT2和VIM基因甲基化技术用于UTUC诊断，具有较高的敏感性和准确性，优于尿脱落细胞学和FISH。 上尿路尿路上皮癌（upper tract urothelial carcinoma，UTUC）是起源于肾盂和输尿管的尿路上皮恶性肿瘤，发病率占所有尿路上皮癌的5%～10%[1]。UTUC的术前定性诊断主要依靠输尿管镜检查和病理活检[2]，目前的无创尿液诊断技术如尿脱落细胞学和荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）等检查的敏感性较低，难以满足临床需求[3-5]。近年的研究结果显示，尿液DNA甲基化等新技术在膀胱癌和UTUC的无创诊断中展现出较高的敏感性、特异性和准确性，有望在临床应用[6-9]。我们的前期研究结果显示，基于ONECUT2和VIM基因的尿液DNA甲基化技术对膀胱尿路上皮癌的诊断性能良好，但该技术能否用于UTUC的诊断以及诊断性能尚不明确[10]。本研究回顾性分析2019年8月至2021年3月中山大学孙逸仙纪念医院和北京大学第一医院收治的107例UTUC患者（UTUC组）和121例上尿路良性疾病患者（对照组）的病例资料，探讨尿液DNA甲基化技术用于UTUC无创诊断的性能和价值。
一、一般资料 本研究病例，中山大学孙逸仙纪念医院UTUC组和对照组分别为53例和100例，北京大学第一医院UTUC组和对照组分别为54例和21例。UTUC组根据病理结果诊断，既往均未接受泌尿系统手术或抗肿瘤药物治疗；对照组根据临床或病理结果诊断，均未接受泌尿系统手术。本研究遵循的程序符合2013年修订的《世界医学协会赫尔辛基宣言》要求。 UTUC组男64例（59.8%），女43例（40.2%）；年龄（67±10）岁；输尿管癌50例（46.7%），肾盂癌42例（39.3%），肾盂癌合并输尿管癌15例（14.0%）；非肌层浸润性UTUC 45例（42.0%），肌层浸润性UTUC 51例（47.7%），分期不明确11例（10.3%）；肿瘤分级低级别14例（13.1%），高级别93例（86.9%）。对照组男81例（66.9%），女40例（33.1%）；年龄（52±14）岁；泌尿系结石104例（86.0%），输尿管狭窄或息肉13例（10.7%），单纯肾积水4例（3.3%）。UTUC组60例（56.1%）和对照组11例（9.1%）行尿脱落细胞学检查。UTUC组72例（67.3%）和对照组9例（7.4%）行尿液原位荧光杂交法（FISH）检查。 二、尿液DNA甲基化检查方法 1.尿液样本收集：有创性检查或操作前收集患者100 ml尿液，3 000 g离心10 min，去掉上清，用1 ml生理盐水重悬沉淀后转移到EP管，3 000 g再次离心10 min，去掉上清，尿液沉渣于-30℃或-80℃保存。 2.尿液DNA甲基化检测：使用QIAamp DNA Blood Mini Kit（德国凯杰公司），按说明书操作提取尿脱落细胞DNA。使用广州市基准医疗有限责任公司生产的甲基化试剂盒，按说明书操作对尿脱落细胞DNA进行亚硫酸氢盐转化和纯化。 具体操作方法：采用三重荧光法行荧光定量PCR，在同一个反应孔中检测ACTB基因保守序列，以及ONECUT2、VIM基因的甲基化情况[11-12]。通过设计保守区域的引物来扩增ACTB基因，作为内参基因评估样品DNA是否足量以及质量是否合格。通过特异性的甲基化引物分别扩增ONECUT2和VIM基因，由不同荧光标记的荧光探针报告扩增信号。 根据ONECUT2与内参基因ACTB的Ct差值（ΔCt值）和VIM基因Ct值，分别与临界值进行比较，获得样本的甲基化情况。结果判定：①当ACTB≤32时，可以进行结果判断，否则样本检测结果无效；②当ONECUT2 ΔCt值≤5.7或VIM Ct值≤38.6时，即ONECUT2、VIM任意一个结果为阳性时，判定为样本阳性；③当ONECUT2 ΔCt值＞5.7（或结果为未检出）且VIM Ct值＞38.6（或结果为未检出）时，即ONECUT2、VIM结果均为阴性时，判定为样本阴性。 3.观察指标：比较3种检查方法的诊断敏感性、特异性、准确性、阳性预测值、阴性预测值。记录尿液DNA甲基化检查用于不同临床病理亚组的诊断敏感性和特异性，以及该技术在不同医院应用的敏感性和特异性。 三、统计学方法 采用R语言3.6.1统计软件处理数据。3种检查方法效能采用率表示，组间比较采用χ2检验。统计柱状图数据以均数和95%CI表示，采用Wald法计算95%CI。以P＜0.05为差异有统计学意义。 3种检查方法的总体性能比较见图1A。尿液DNA甲基化检查的总体敏感性为84.1%（90/107例），特异性为90.9%（110/121例），准确性为87.7%，阳性预测值为89.1%，阴性预测值为86.6%。尿液DNA甲基化技术诊断UTUC的敏感性明显优于尿脱落细胞学（43.3%）和FISH（69.4%），准确性明显高于尿脱落细胞学（52.1%）和FISH（71.6%），差异均有统计学意义（P＜0.05）；特异性与尿脱落细胞学（100.0%）和FISH（88.9%）相当，差异无统计学意义（P＞0.05）。
尿液DNA甲基化检查对不同位置肿瘤的诊断敏感性见图1B，输尿管癌、肾盂癌、肾盂癌合并输尿管癌分别为74.0%（37/50例）、90.5%（38/42例）、100.0%（15/15例）；对不同良性疾病的诊断特异性见图1C，泌尿系结石、输尿管狭窄和息肉、单纯肾积水分别为92.3%（96/104例），84.6%（11/13例），75.0%（3/4例）。尿液DNA甲基化技术在两个中心的诊断性能见图1D，在中山大学孙逸仙纪念医院的诊断敏感性和特异性分别为83.0%和92.0%，北京大学第一医院的诊断敏感性和特异性分别为85.2%和85.7%。 3种检查方法在不同病理亚组中的诊断效能比较见图2。在低级别UTUC中，尿液DNA甲基化检查的诊断敏感性为64.3%，明显高于尿脱落细胞学的20.0%和FISH的36.4%，差异有统计学意义（P＜0.05）；在高级别UTUC中，尿液DNA甲基化的诊断敏感性为87.1%，高于尿脱落细胞学的48.0%和FISH的75.4%，差异有统计学意义（P＜0.05）。在非肌层浸润性UTUC中，尿液DNA甲基化检查的诊断敏感性为77.8%，明显高于尿脱落细胞学的29.2%和FISH的64.5%，差异有统计学意义（P＜0.05）；在肌层浸润性UTUC中，尿液DNA甲基化的诊断敏感性为88.2%，优于尿脱落细胞学的53.6%和FISH的72.7%（P＜0.05）。
上尿路和膀胱尿路上皮癌都属于尿路上皮癌，既往研究结果表明他们在发病分子机制上具有较高的相似性[13-14]，且用于膀胱尿路上皮癌的诊断方法和标志物如尿脱落细胞学、FISH、NMP22、DNA甲基化和RNA标志物等，也能用于诊断UTUC[15-17]。目前，国内UTUC辅助诊断开展较多且成熟的技术是尿脱落细胞学和FISH[18]，但尿脱落细胞学诊断UTUC的敏感性较低，为41%～43%；FISH诊断UTUC的敏感性中等，为55%～72%。本研究结果显示，尿脱落细胞学和FISH诊断UTUC的总体敏感性分别为43.3%（26/60例）和69.4%（50/72例），与既往文献报道的性能相近，说明基于现有临床应用技术仍有30%～55%的UTUC患者无法通过尿液无创检查实现术前定性诊断，可能需要输尿管镜检查和活检。 近年来，基于尿液DNA甲基化、突变、拷贝数变异和mRNA表达，开发了多项尿液无创诊断技术，在UTUC中展示出较好的诊断性能[19]。近期一项研究纳入97例患者，比较了4种尿液诊断方法，包括基于5个mRNA表达的Xpert-BC-Detection、基于15个基因DNA甲基化的Bladder-Epicheck、基于染色体异常的Urovysion-FISH和尿脱落细胞学，结果显示Xpert-BC、Epicheck、FISH和尿脱落细胞学诊断UTUC的敏感性分别为100.0%、64.5%、87.1%和41.9%，这4种方法的特异性分别为4.5%、78.8%、81.8%和93.9%[20]。在另一项小样本单中心研究中，Xpert-BC的诊断敏感性和特异性分别为100.0%和16.7%[21]，说明Xpert-BC的诊断敏感性很高，但特异性很差，用于诊断UTUC可能会出现很多误诊（假阳性），因此不适用于UTUC的辅助诊断。一项Epicheck用于UTUC的小样本单中心研究结果表明，其敏感性和特异性分别为83%和79%。本研究基于尿液ONECUT2和VIM基因甲基化技术的诊断敏感性和特异性分别为84.1%和91.7%，优于Xpert-BC和Epicheck，但仍需开展头对头临床研究来证实。 本研究临床亚组分析中，尿液DNA甲基化在低级别和非肌层浸润性UTUC中的诊断敏感性分别低于高级别和肌层浸润性UTUC，说明这2个DNA甲基化在早期肿瘤中的改变少于晚期肿瘤，所以敏感性相对较低。但对3种检查方法敏感性的比较中，DNA甲基化均优于尿脱落细胞学和FISH，上述结果与文献报道的膀胱癌相关研究结果一致[10]。此外，本研究结果还显示，尿液DNA甲基化检查在2家医院中应用的敏感性和特异性基本相当，说明该技术的稳定性较好。 综上所述，基于尿液ONECUT2和VIM基因的DNA甲基化技术用于诊断UTUC具有较高的敏感性和准确性，优于尿脱落细胞学和FISH，为UTUC的术前定性诊断提供了新方法。未来仍需多中心、前瞻性、更大样本量的研究进一步验证该方法的临床应用性能，评估其是否能替代部分患者的术前输尿管镜检查。  |
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