胶原蛋白 红外光谱特征峰2.2.1蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定方法很多，如凯氏定氮法、Lowey法、考马斯亮蓝法、双缩脲法、紫外比色法、
福林酚法等。凯氏定氮法是最基本的方法，也是其他测定方法的基础,因为其他方法需要标品,而标品的含量一般需要凯氏定氮法来定量，因此，在
样本量大的情况下，建议使用凯氏定氮法，而在其他情况下建议使用考马斯亮蓝法。需要强调的是,测定胶原蛋白的蛋白质含量时一般不建议使用福
林酚法，尽管该方法比较灵敏,但胶原蛋白提取过程中经常用到的柠檬酸会影响测定结果[8]上述测定方法都是常规方法，这里就不再赘述。2.
2.2氨基酸组成的测定1.常规氨基酸组成测定目前,氨基酸组成的测定主要利用高效液相色谱仪和氨基酸自动分析仪，两种方法的测定步骤比较
固定，前处理使用酸水解法，这里不做叙述。表2-5中列出了三种不同来源胶原蛋白经过氨基酸自动分析仪测定的常规氨基酸质量分数。从表2-
5中可以看出,在三种不同来源的胶原蛋白中，甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸所占质量分数较高，甘氨酸的质量分数最高，占总质量分数的30%左右，
脯氨酸的质量分数占总量的10%左右，但三种鱼皮胶原蛋白的氨基酸组成仍存在一些差异。鱿鱼皮胶原蛋白中天冬氨酸(Asp)含量较高,鳕鱼
皮胶原蛋白中蛋氨酸(Met)、亮氨酸(Leu)含量较高,而鲤鱼皮胶原蛋白中赖氨酸(Lys)含量较高，三种鱼皮胶原蛋白中谷氨酸(Gl
u)和丙氨酸(Ala)的含量都较高。总体来看,根据提取胶原蛋白的常规氨基酸组成的测定结果，符合胶原蛋白的氨基酸组成特征，可以证明所
提取的鱼皮蛋白质是胶原蛋白。2.色氨酸含量测定由于胶原蛋白含有的色氨酸很少，甚至是没有。因此，很多文献在研究鱼皮胶原蛋白氨基酸组成
时，并不测定色氨酸。色氨酸在酸性条件下十分不稳定，因此，如果在测定氨基酸组成时前处理使用酸,色氨酸将被破坏。为测定色氨酸，采用的前
处理方法为碱处理[9],方法如下:准确称取样品，置于聚四氟乙烯管内，在聚四氟乙烯管内加人碱水解液1mL，使样品均匀湿润，然后把管子
放入玻璃试管中，在玻璃管上端，离聚四氟乙烯管4~5cm处，用喷灯灼烧并拉成细颈，冷却后，接在真空泉的抽气管上，减压至7Pa后封口。
把管子放在(110+1)℃的恒温干燥箱内水解20h,取出冷却,将水解液定量转移到25mL容量瓶内，用6mol/L盐酸中和后，再用p
H43的缓冲溶液定容,过滤后供测定色氨酸含量用，测定除了上述使用的液相色谱仪和自动氨基酸分析仪外，还可以使用分光光度计。目前，碱水
解液常用的为两种:一是内含5%氯化亚锡的5mol/L氢氧化钠溶液，现用现配;二是4mol/I氢氧化锂。3.羟脯氨酸含量测定羟脯氨酸
是胶原蛋白的特征成分。羟脯氨酸仅存在干胶原蛋白、弹性蛋白和伸展蛋白中，而不存在干一般蛋白质中0]。对同一原料而言，羟脯氨酸的含量乘
以一定系数可得到胶原蛋白的含量，例如:鳕鱼皮、鱿鱼皮和鲤鱼皮的羟脯氨酸换算系数分别为746、14.12和9.75。因此，测定了羟脯
氨酸的含量就可以用来衡量胶原蛋白的含量。具体测定方法如下[11]:①试剂的配制。缓冲溶液的配制:3g柠檬酸，15g氢氧化钠和9g乙
酸钠用水溶解后,转移至100 mL容量瓶中,然后加入29 mL甘油,用水稀释至刻度②氯氨T试剂的配制。取氯氨T141g溶于100m
L缓冲液中。③发色剂的配制。溶解10g对二甲氨基苯甲醛于35mL60%的高氯酸中，慢慢地并不断摇动加入65mL异丙醇④样品的测定。
称取样品5mg左右，加入1mL6mol/L的盐酸，在130℃下水解4h,然后取1mL水解液加人2滴0.02%甲基红指示剂，用氢氧化
钠溶液调溶液至淡黄色，用蒸馏水定容至100mL。取其中的2mL溶液,加1mL氯氨7试剂，振摇试管，并在室温下放置(20士2)min
，在每个试管中加人1mL发色剂充分混合,试管置于(60士5)℃的水浴锅中准确放置15min，在流动的自来水下冷却试管至少3min，
擦干试管，(558士2)nm处测吸光度值，由标准曲线得羟脯氨酸的含量。2.2.3紫外光谱分析紫外光谱分析一般是将提取到的鱼源胶原蛋
白样品溶解于05mol/L乙酸溶液中，配成浓度为1g/L的胶原溶液，在190~400nm的近紫外光区进行全波长扫描。图2-4是三种
鱼皮胶原蛋白的紫外扫描图。一般来讲，具有共轭双键的物质都具有紫外吸收,在二十种常规氨基酸中，有四种是具有共轭双键的:TrpTyrP
he和His,其中Trp的紫外吸收最强，在280nm的紫外吸收较强，所以大多数蛋白质在280nm都有一个很强的紫外吸收，并可通过对
280nm紫外吸光度的测量，达到对蛋白质溶液进行定量分析，但由于胶原蛋白几乎不含Trp，所以在280nm没有出现强吸收峰，这可以作
为鉴定胶原蛋白的方法。从图2-4可知，胶原溶液大约在220~230 m处有一个吸收峰,与资料报道的胶原蛋白吸收峰(225nm附近)
位置一致，是胶原蛋白的特征紫外吸收，这个吸收峰包括了电子的 N→元''和N→σ"跃迁产生的强吸收[12]。2.2.4傅里叶变换红外光
谱分析傅里叶变换红外光谱(FTIR)目前普遍应用于肽和蛋白质的结构分析，主要是用于估计二级结构元素的含量[13]。将适量胶原蛋白样
品和KBr混匀研成粉末状压片,将样品放人样品室,用傅里叶变换红外光谱仪在400~4000cm-区间扫描，分辨率设置为2cm一。每一
种化合物都具有其特殊的红外光谱，高分子化合物中的不同基团具有不同的红外吸收峰。红外光谱图上每一个吸收峰都对应分子中原子或官能团振动
的情况。图2-5为鳕鱼皮酸溶性胶原蛋白(ASC)的红外光谱图[14]。由图可知，ASC在3328cm-1处的吸收峰是酰胺A带的VN
-H伸缩(氢键)振动2933cm-1附近是酰胺 B带的vc-H伸缩振动[15],样品在1648cm一处出现较强的吸收，是酰胺I带的
vo-伸缩振动强峰,它与蛋白质的二级结构紧密联系在一起，胶原在1541cm-处是酰胺Ⅱ带的VNH弯曲振动吸收峰;1236cm-1为
酰胺Ⅲ带的VN-H的变形峰;1452cm-1表明螺旋结构的存在[16]。因此，FTIR图谱证明了ASC存在特殊的三螺旋结构。2.2
.5分子质量类型确定鱼源胶原蛋白分子质量及类型一般采用SDS-PAGE电泳法测定[17]。配制浓度为4mg/mL的胶原蛋白(溶解过
程可加入少量尿素促溶)，取20uL溶液分别加人5uL5x样品缓冲液(60mmol/LTris-HCl缓冲溶液，25%甘油，2%SD
S14.4mmol/L巯基乙醇,01%溴酚蓝)或不含巯基乙醇的5uL5x样品缓冲液。100℃者沸7min鱼源胶原的亚基分子质量一般
大干100kDa，因此，采用浓缩胶浓度一般为5%,分离胶浓度一般为75%，SDS-Tris-甘氨酸系统电极缓冲液进行 SDS-PA
GE电泳。染色液:0.25%考马斯亮蓝R-250溶液;脱色液:75mL冰醋酸+50mL甲醇+875mL蒸馏水混合。图2-6为鳕鱼皮
酸溶性胶原蛋白(ASC)的SDS PAGE电泳图谱[14]。由图可知，该胶原主要含β及a链，含少量r链。鱼皮的胶原蛋白是由至少两条
不同的。链组成,即al和a2,也可能是含有与a1链相关的a3链，但在本试验的试验条件下，a3链没有被分离出来。根据待测样品的迁移率
看出鱼皮胶原的两条a带的分子质量为974~130kDa，与文献报道的相近。比较图2-6中的蛋白样品1及2的电泳图谱发现,两个样品的
电泳图谱完全一致，巯基乙醇的添加对胶原蛋白的电泳图谱无影响,说明在鱼皮胶原三螺旋区无二硫键18]。从电泳谱图可以看出，鳕鱼皮胶原蛋
白制品的纯度比较高,并且符合胶原蛋白电泳图谱的一般特征。2.2.6热稳定性测定1.热变性温度(T)胶原蛋白的热稳定性是由其在溶液中
分子的热变性温度(T)来表达的，而T又是通过胶原蛋白的热变性曲线反映出来的。胶原蛋白的热变性温度可以由黏度测定来确定[19]。从胶
原蛋白热变性温度曲线上，找到增比黏度变为原料的50%时所对应的温度即为热变性温度Td。方法如下:用乌氏黏度计测定12~50℃(间隔
4℃)范围内的增比黏度(nsp/c)，样品浓度0.03%，溶剂为05mol/L乙酸，各温度保持恒温30min。以(nsp/c)T/
(nsp/c)20作图，增比黏度变化50%时所对应的温度即为Td。图2-7给出了三种不同的水产动物皮中提取的胶原蛋白的热变性曲线，
从曲线上可以得知提取的三种胶原蛋白的热变性温度T。由试验测定的鲤鱼皮、鱿鱼皮和鳕鱼皮胶原蛋白的热变性温度T分别为319℃、26.8
℃和24.2℃。有研究指出,胶原的热稳定性与全部的亚氨基酸尤其是羟脯氨酸的含量呈正相关,这类氨基酸的含量越高，胶原蛋白的稳定性越强
。亚氨基酸的吡咯环对胶原二级结构的固定化以及由羟脯氨酸的羟基所形成的氢键对胶原的稳定性起着很大的作用[20]。水产生物胶原蛋白的热
变性温度不受种属的影响，而与水产动物可能生息的最高环境温度大致相等[21]。由于水产动物脯氨酸和羟脯氨酸的含量比陆生动物低,从而导
致水产动物胶原蛋白的热变性温度比哺乳动物来源的胶原蛋白低。通常水产动物通过脯氨酸酶控制脯氨酸的羟基化率，调节羟脯氨酸的含量以适应环
境温度,起到保持胶原热稳定性的作用。从试验数据来看，三种鱼皮胶原蛋白的热变性温度基本接近它们生息的环境温度。2.热收缩温度(T)热
收缩温度(T)被定义为胶原纤维收缩至原来长度的1/3时的温度，此温度下，胶原内部氢键断裂，天然三螺旋结构被破坏[22]。热收缩温度
(T)一般采用差示量热扫描法测定。方法为:准确称取胶原蛋白8mg左右于铝坩埚中,坩埚加盖密封,以空坩埚作为参比，用差示扫描量热仪测定T扫描范围20~100℃，升温速率为2℃/min。由图2-8可知,牛皮工型胶原的T为61.67℃,而鳕鱼皮胶原蛋白的T为46.96℃，低于牛皮胶原,是由于热收缩温度与全部亚氨基酸(脯氨酸+羟脯氨酸)的含量存在正相关性[23]，这与T类似。另外，水产动物胶原蛋白的 T与T值之差不受种属影响,大致恒定(20~25℃)[19],鳕鱼皮胶原蛋白显然符合这一特点。 |
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