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营养物质以不同方式进人微生物细胞后，经一系列酶催化分解为简单的化合物，这一过程就是微生物的分解代谢或异化作用。同时，微生物又能将上述分解产物合成菌体的结构物质，这就是合成代谢或同化作用。微生物经同化与异化作用来维持其正常的生长发育全过程就是微生物的新陈代谢。 与新陈代谢对物质的同化同化学作用相比具有：新陈代谢反应都在温和条件下进行的为酶所催化。反应有一定的顺序特点。反应还有灵敏的自我调节。徽生物发酵工程正是利用这些特点，通过对微生物的培养，以营养物质为底物经其代谢作用转化而积累某些特定的代谢产物。目前人们在认识和研究微生物代谢基础上已由野生型菌株的发酵向高度人为控制代谢发酵转移。由依赖微生物分解代谢产物发酵向依赖于生物合成代谢的方向转移。为此，本章将分别介绍微生物对营养物质的分解，以区与此有关的微生物的酶和呼吸作用，最后简要谈谈代谢调控及其在发酵生产中的应用。 一、微生物的酶及其作用 微生物体内的新陈代谢包含着许多复杂而有规律的物质转化和能量变化。有一些微生物能将简单的无机物如 CO2、无机盐等，经一系列生物化学变化合成复杂的有机物;也有一些微生物可将有机物经生物氧化分解和合成反应转化为菌体自身物质和不同的代谢产物，使微生物得以生长繁殖。无论那种类型的微生物所进行的一系列的生物化学反应都必须在不同的酶的催化作用下完成。 （一）酶的特性 微生物的酶是由菌体细胞产生的一种有生理活性的蛋白质。在水溶液中呈胶体状态，水解后可产生氨基酸。因此，凡能使蛋白质变性的种种因素：高温、强酸、强碱和重金属等也会会导致酶活性的丧失。就其酶的组成来看，有一类由单纯的蛋白质所构成称单成分酶，如水解酶类;另一类则是由蛋白质（主酶)与非蛋白质部分（辅酶或辅基)组成称复合酶。在一定条件下，微生物的酶类从菌体中分离出或被提纯结晶仍具有酶的特性。 酶能在微生物体内迅速而顾利地催化十分复杂的生物化学反应,就在于因酶的存在而降低了反应所需的活化能，从而使酶所催化的反应具有很高的效率。例如过氧化氢的分解有三种不同的方式：自发分解、铂催化分解和过氧化氢酶的催化分解。三者相比，过氧化氢酶分解效率最高。因此，当微生物代谢过程中过氧化氢产物一形成，很快就为菌体内的过氧化氢酶所分解，否则微生物就难以生存，因这一中间产物有剧毒性。 正由于微生物菌体内复杂多样的生理生化反应有条不紊地进行，才使各种微生物表现出各自的代谢特性。之所以如此,正是由于酶对细胞内生化反应的催化作用具有高度的专一性，就是酶对底物有严格的选择性。某一种酶只能对某一类或某一种底物起作用，促进一定的反应生成特定的产物。例如蛋白酶只能水解蛋白质为底物的生化反应,生成一系列蛋白水解产物;淀粉酶只能催化以淀粉为底物的生化反应生成淀粉水解产物等，它们彼此不能互相替代。 （二）影响酶作用的因素 酶所催化的反应需要在一定的温度、pH值、酶和底物浓度等条件下,才能正常地进行。如果这些因素发生变化就会显著地影响酶促反应的效率，甚至使酶丧失其催化活性。酶的催化反应对温度极为敏感。在低温条件下，反应进行十分缓慢。超过 60度温度时,多数酶类又将失去其活性。因此只有在一定的温度范围内，其催化速度才能同温度增高成正比关系。催化效率最高时的温度则是该酶的最适温度。一般酶类的最适温度在 40~50度汇之间。 pH 值能改变酶蛋白的解离状态，因此酶反应的速度极易受环境中酸碱度的影响。每一种酶都有其最适的 pH 值，在此条件下，酶催化活性最高。如酸性蛋白酶在 pH2~5;中性蛋白酶在 pH7~8;碱性蛋白酶在 pH9.5~ 10.5 活力最大，催化效率最高。 在酶促反应中，还有一些物质如重金属离子 Hg、Ag、Cu离子和碗化氢、氰化物、氟化物等能使酶活性降低,称为酶的抑制剂;也有另一些物质如 M3+、 Mo+、K+等能使酶的活性提高称酶的激活剂。可见了解和认识酶的抑制剂与激活剂，在理论研究、发酵工程以 及酶工程应用上都有极其重要的意义。 此外，酶的浓度与底物农度的变化也会影响酶促反应的正常进行。一般说来，在其条件相同的情况下，两者各自在一定的浓度范围内,浓度越高，反应速度越快。但当其超过一定的速度范围后，在提高酶或底物的浓度也不会增高反应的效率。 （三）微生物酶的种类及其应用 人们根据酶催化反应的性质，把微生物的酶分成：水解醇类、氧化还原酶类、裂解酶类、转移酶类、异构酶类和合成酶类。 1. 水解酶类 这类酶是催化某些物质的加水分解反应，使这些物质由复杂的大分子水解为简单的小分子。该类酶为微生物的胞外酶，具有分布广泛，数量多的特点。微生物分巡产生的水解酶类有淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶等，可对其相应底物淀粉、蛋白质、脂肪和纤维素催化水解成糖、氨基酸、脂肪酸等小分子。可见水解酶类不仅对微生物的营养物质吸收起着重要的作用，而且也在以农副产品为原料的发酵工程与酶工程中有广泛的用途，见表2-1。
2．氧化还原酶类 这类酶包括氧化酶、过氧化氢酶和脱氢酶等。是催化菌体内各种各样的氧化还原反应的酶类。在微生物呼吸作用中起着极为重要的作用。氧化酶、过氧化氢酶在好气性微生物中普通存在,因此在其有氧呼吸中起着重要的作用;厌气菌类则缺乏氧化酶类。脱氢酶所催化的反应总是伴有氢的转移。可见氧化还原酶类是具有生物氧化功能并获取能量反应的酶系,它们都需有辅酶或辅基的参与。 微生物细胞内的氧化还原酶种类很多，但生产上应用较少。近年来仅在三废处理中，曾试验多酚氧化酶经固定化之后，用以检测废水中的含酚量。 3.裂解酶类 为一类催化底物裂解、脱羧和脱氨的酶类。在菌体内物质转化和能量转化反应中起着重要作用。例如发酵法生产甘油时，有一关键性的中间反应，就必须通过醛羧酶的催化，使二磷酸果糖分裂成两个三碳糖，这两个三碳糖在经其他酶的作用转化成甘油。 4. 转移酶类 催化某一基团由一种化合物分子上转移到另一种化合物分子上的酶类，就是菌体内的转移酶类。例如氨基酸转移酶能将丙氨酸上的氨基转移到a一酮戊二酸分子上形成谷氨酸。
5. 异构酶类 为菌体内同分异构物相互转化的重要酶类。例如在菌体细胞质里，糖酵解过程中，6-磷酸葡萄糖要变成6一磷酸果糖就是为该类酶所催化完成的。目前在淀粉糖的生产中，也是应用此酶使葡萄糖发生异构化，进而生成果葡萄浆。 6. 合成酶类 一般说有三磷酸腺苷参与的合成反应的酶类。因此是关系到许多重要生命物质形成的酶类。例如谷氨酰胺合 成酶，L-丙氨酸转移核糖核酸合成酶均属此类酶，它们在菌体蛋白质合成中起有极大的作用。 利用微生物进行发酵，就其实质上讲也就是细胞所存在的各种酶类的催化反应。将底物(营养物质)经若千生物化学反应的转化，最终形成人类所需的产物。如对形成最终产物的代谢途径和所需的酶类已搞清楚，同时给以必要的底物，则酶的催化效率将有希望进一步提高。因此,最新的发酵工程将趋向于利用固定化酶和固定化细胞，在柱式反应器内连续发酵生产所需的发酵产物。 二、微生物的呼吸作用与产能代谢 微生物对营养物质的分解代谢过程，就是通过呼吸作用来实现的。微生物的呼吸作用包括菌体内的一系列的生物化学变化和能量转化的生物氧化作用，而且这些反应都是由多种多样的呼吸酶类所催化完成的。 （一）呼吸作用的类型 由于在呼吸作用过程中，微生物与分子氧的关系不同,可将微生物呼吸分为下列类型。 1.好气性微生物的有氧呼吸 许多细菌、放线菌和真菌都要从空气中索取分子氧进行呼吸，以氧气作为基质氧化分解的最终受氢体，使基质彻底氧化生成二氧化碳和水并释放出全部能量。在有氧呼吸过程中，參子催化反应的呼吸酶类主要有脱氢酶系和氧化酶系。 可见脱氢酶系是包括使氢从基质里脱下来并进行传递的一系列酶与辅酶，从而使基质脱氢氧化。氧化酶系是指细胞色素与细胞色素氧化酶类，接受并传递电子和激活分子氧,使之成为氢的最终受体生成水。 根据微生物的这一生理特性，在发酵工业生产中,采用通人无菌空气于发酵器中并加以搅拌,来保证好气微生物进行有氧呼吸，分子氧的充分供给，使菌体正常生长发育并积累其代谢产物。 2.厌氧菌的无氧呼吸 有一类微生物在生物氧化过程中，以无机氧化物作为最终氢的受体就是无氧呼吸。这类微生物往往生长在缺氧的环境中，进行不需氧的呼吸作用。细胞内只有脱氢酶而缺乏氧化酶系，从基质里所脱下来的氢只能传递给无机物或有机物使之还原,其结果基质氧化不如有氧呼吸彻底，所释放出来的能量也较少。 在此类无氧呼吸中，如最终受氢体是无机氧化物则称分子外的无氧呼吸，如果最终受氢体是基质的分解中间产物(如乙醛)则称分子内的无氧呼吸，也称发酵作用。 3. 兼性微生物的呼吸 在有氧条件下，借助于脱氢酶和氧化酶系的共同协调的催化作用，进行有氧呼吸;而在无氧条件下，又能使菌体内的氧化酶系受到抑制，仅依靠脱氢酶系作用进行无氧呼吸,因此，这类微生物既能在有氧又能在无氧环境中生长发育称兼性微生物。 酵母菌在无氧条件下进行乙醇发酵,产生乙醇、二氧化碳和少量的能量,当其在有氧时则可将相同的底物分解氧化成二氧化碳、水和比乙醇发酵产生更多能量。因此,酵母这类兼性微生物，在利用等量的能源物质过程中，有氧环境生长所得到的细胞产量比缺氧时高得多,同时巴斯德还发现，氧对酵母的乙醇发酵有显著的抑制作用，这种抑制的调控作用称为“巴斯德效应”。现在运用酵母菌生产啤酒，酒精所采取的隔绝或排除空气的措施以及生产大量酵母菌体的通气培养，正是利用微生物机体代谢自我调控的特性。 （二）呼吸中的产能代谢 呼吸作用的重要生理机能就是在分解营养物质时，以各种不同的方式释放出能量，去满足微生物生长发育的要求。 1.化能异养菌的产能 能源物质一般以葡萄糖的形式进人菌体，进一步的分解过程则因微生物种类和条件不同而各异，好气性类的菌种在有氧条件下就能进行呼吸产能;厌气性的菌种在无氧条件下进行发酵产能，例如酵母菌类的产能代谢;还有细菌类的微生物在无氧条件下,则能无氧呼吸产能。 在反应中所出现的放能多少不同，主要由于反应的条件差异而对底物分解的程度有产能方式所决定。它们三者在糖的酵解中所生成的 2ATP、2丙酮酸，2NADH。进一步的分解氧化由于菌种与条件的不同而出现这三种情况。表明在其酵解过程中，都能在其底物被氧化过程中发生磷酸化作用。即能形成某些含高能磷酸键的中间产物，这类中间产物又可经相应酶的催化，将其高能磷酸键转给 ADP,生成 ATP。也就是底物水平磷酸化产能。在发酵作用过程中，因 2NADH,将其所带到的氢转交给乙醛生成了乙醇,故底物水平磷酸化成了发酵作用的唯一产能方式。因此产能很少，底物分解也不彻底。 有氧呼吸过程中除具有酵解中的底物水平磷酸化产生 2ATP外，从底物上逐步脱下来的氢，可经 NAD+、FAD+,细胞色素和细胞色素氧化酶等中间传递体，最后将氢给分子氧生成水。并在此过程中发生三次磷酸化，即呼吸链的氧化磷酸化产能。1个还原型辅酶I (NADE,)可产生了ATP,1个还原型黄素蛋白的辅酶(FADI,)可产生 2× ATP。因此，有氧呼吸除具有共同的底物水平磷酸化产生 2个 ATP 外，其底物上所脱下来的氢也要经一系列的中间传递体(即呼吸链但不完整)将氢交给氧化物中的氧而不是分子氧,生成水和二氧化碳和较少的能量。原因是硝酸盐还原酶从细胞色素b接受了电子，并传递给 NO5 生成 NO。因此，无氧呼吸的中间传递体比有氧呼吸就少了一些。1个NADE,经氧化磷酸化仅生成2个 ATP而不是了个 ATP,故总产生能量仅为 26ATP。 由此可见，微生物的有氧和无氧产能中，从底物所脱落下来的氢经一系列传递体，才能转交给最终受体。这些中间转递体以一定顺序排列成链状即呼吸链。 此呼吸链在细菌类原核徽生物存在于间体内(mesosomo)。酵母和霉菌类真核微生物则存在于线粒体中。正因结构上有如此的差异，使它们产能上也不相同。见表2-2。
2. 化能自养菌的产能 由于这类微生物在进行呼吸作用时的底物不是有机物而是无机物，故不能象异养菌那样分解产能。它们在产能中需要大量的氧气，才能使无机物底物发生氧化,产生能量使二氧化碳还原成有机物。 这类微生物中的硝化细菌，它们能使士壞中的氨转化为硝酸，利于提高士壤的肥力,同时在氨氧化的过程中所放出的能量由于还原二氧化碳合成有机物。此外，细菌浸矿也是利用自养菌的代谢活动所生成的硫酸和硫酸铁作为溶剂进行化学反应，將矿中金属溶浸出来。 （三）微生物的能量转化 微生物同任何生命体系一样，具有产生能量,利用能量和转化能量的特性。能在生命体系中表现为多种形式：菌体的运动，鞭毛和伞毛的拍击,细胞质的流动,细胞器的转动以及细胞形态的改变等所耗的能量统称为机械能。电能和电磁能也是生物体内常见的能量形式之一。光能为一些微生物所利用，如光合细菌，但也有一些微生物能在其生命活动中产生光能称发光生物;化学能则是许多微生物在其呼吸作用中，从有机物或无机物的分解氧化所产生的一类能量，是微生物重要的能源，在菌体内常以 ATP(三磷酸腺苷）的形式存在(见表2-3)
由此可见,微生物在呼吸作用中所产生的能以及形成的 ATP,除了供体内新的物质合成需要之外，还有在营养物质的吸收、菌体鞭毛运动等多方面的用途。据测定啤酒酵母或粪链球菌，在无氧条件下，以简萄糖为能源物质所产生的 ATP,其中1/3用于生物合成,2/3 则以菌体运动和热的形式所散失。 三、微生物对营养物的分解及其代谢产物 微生物从生活环境中，吸收其所需的碳源和氮源等营养物质，经菌体的一系列分解作用之后，所产生的中间产物进一步同化为菌体结构的组成部分或以贮存物的形式存放于细胞里。还有一些代谢产物成为分泌物或排泄物，排放到菌体生长的基质中。微生物分解营养物质所产生的代谢产物，其中很多对人体非常有用，因此,人们过去通过传统发酵，今天则以发酵工程去索取微生物的代谢产物。可见认识了解微生物对营养物质的分解以及微生物的代谢产物,对发酵工程是非常重要的。 （一）微生物对碳素营养物质的分解 微生物的碳素营养物质主要包括淀粉、纤维素、半纤维素、几丁质和果胶多糖类及其水解产物，其中最重要的是淀粉及其水解产物一葡萄糖。淀粉之所以是微生物重要的碳素营养物质，一是来源广泛而且十分丰富,农副产品和野生植物都含有大量的淀粉;二是能被大多数微生物分解利用。因此，在发酵工程中常以淀粉作碳源，经微生物转化，而生成一系列的发酵产品。 微生物分解淀粉是在淀粉酶类催化作用下进行的。依照微生物淀粉酶类作用的机制不同,可分阿尔法一淀粉酶，贝塔一淀粉酶，葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶等类型。这些酶类共同对淀粉分解的结果,形成葡萄糖和果糖等己糖类物质。绝大多数异养菌都能利用葡萄糖等作为碳源和能源，其他己糖也需转化为葡萄糖后才能进一步被分解利用。不同类型的微生物对葡萄糖分解方式和途径也不一样。 (1）好气菌的有氧分解如图2-1。
（2）葡萄糖的无氧分解如图 2-2。
由此可得其总的反应式：
当其经上列有氧分解街萄糖时，出现异常代谢，就有可能导致某一中间产物的积累，而成为人类所需的发酵产品。在发酵工业中，像柠檬酸发酵，谷氨酸发酵以及很多的抗生素发酵生成，就是人为干扰微生物菌体内葡萄糖分解代谢，而造成一些中间代谢产物或次生代谢产物的积累。 兼性和专性厌氧菌均能在无氧的条件下，以图示的不同途径对葡萄糖进行分解，并可生成多种多样的代谢产物。人们正是利用微生物的这些转化特性，形成了许多工业发酵产品。例如酒精、乳酸、丙酮与丁醇等。 （二）微生物对蛋白质的分解 蛋白质及其分解产物和一些无机含氮物都可以作为微生物的氮素营养物质,甚至分子态氮也可作一些微生物的氮源。微生物对蛋白质及其水解产物的分解过程如图 2-1。
蛋白质被肽酶作用生成氨基酸，脱氨作用生成有机酸，脱羧作用生成胶类。由于微生物种类的不同，所具有的蛋白酶系以及脱氨、脱羧酶差异很大。所以对蛋白质及其分解产物的代谢方式也是多种多样的。在发酵工业中，传统的酱制品 、酱油、豆豉和豆腐乳等，就是利用一些霉菌分泌产生的蛋白酶类，使豆质原料中的蛋白质被水解为有鲜味和营养的食品;近代工业还利用微生物发酵所得到的蛋白酶制剂，作为消化剂和洗涤剂等。 （三）微生物代谢的调节、控制及其应用 物质一系列的变化，在菌体外和菌体内靠多种酶的催化，而这些酶的活性与生成又在多种机制严格控制之下,这些机制确保了代谢过程中准确无误而又有条不紊地进行。 1.微生物酶的诱导产生 当其微生物生长在含有某类糖的培养基中，该种糖就起着信号(或引物)作用，通过菌体合成机构产生能分解此糖的酶。故称这类由诱导而产生的酶为诱导酶。除此之外，菌体也能在无诱导物存在的条件下,产生具有分解某些特定糖类的酶，这类酶就是微生物的组成酶。 2.酶的阻遏作用 当其菌体生长环境不具有某种氨基酸时，制造这种氨基酸所需要的一系列酶易于形成。 如把这一氨基酸直接加人到生长的环境中，它就可作为一个信号去触发菌体细胞的控制机构关闭(阻抑)酶的生成，以免消耗原料去制造暂时不需要的酶。诱导与阻遏的区别：前者是底物的存在诱导了分解它所需酶的产生;后者则是菌体内代谢产物过量的存在阻抑了产生它们所需酶的形成。 3. 终产物抑制作用 这种调控机制与阳遏作用不同之处在于,其终产物所影响的不同。前者作用的对象不是酶的形成，而是使酶的活性受到抑制,反应中的第一个酶而不是全部酶都受到影响。終产物同系列反应中第一个酶结合并抑制其酶的活性，也称反馈抑制。微生物代谢调节机制的不同类型可见图2-3及其说明。 4.调节机制在发酵工业中的应用
由上图可见,当含碳、含氮营养物质进人菌体后，经一系列代谢反应将会产生氨基酸、核苷酸等物质。这些产物又能对自身代谢途径中第一个酶起反馈抑制或对酶的形成起阻遏作用。同时这些产物也可因菌体细胞膜透性作用而渗出体外,进而降低产物的浓度，使微生物代谢过程受到多种机制微妙的调节控制。在发酵工程中则根据微生物的生物学特性,通过微生物的环境和遗传因素去突破菌体上述种种调节控制，而使代谢产物大量的积累。目前主要有了种方法：营养缺陷型突变菌株的应用。即经某种方法使正常代谢反应中某一步骤发生缺陷，导致系列代谢反应不能完成，最终产物不能积累到引起反馈抑制，因而有利于中同产物的生成与积累。 利用这种方法可使枯草杆菌的精氨酸缺陷型积累16g/L瓜氨酸，谷氨酸棒状短杆菌的精氨酸缺陷型能产生26g/L鸟氨酸等;另一种方法是筛选具有抗反馈调节的突变菌株，使这些菌株能摆脱正常的反馈调节机制的作用而积累大量的终产物。在苏氨酸产量的研究中，把反馈抗性突变与降低末端产物浓度结合起来，筛选出新的突变菌株使苏氨酸产量达6g/L;还有一种方法就是通过改变菌体细胞透性，使最终产物渗出体外，而不引起菌体内的反馈抑制调节。在谷氨酸发酵的生产菌株就是利用生物素等改变其细胞膜的透性，使所生成的谷氨酸排出胞外，增加谷氨酸在发酵液中的积累。 近年日本科学家利用固定黄色短杆菌的原生质体生产谷氨酸其生产率比固定菌体细胞提高2.5倍。这就在于去除细胞壁的原生质体透性增强，而促进谷氨酸等向细胞外分泌，同时经固定后的原生质体不易受渗透压的变化而发生破裂。 |
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