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本期小编分享一篇题为Identi fication of cervical cancer stem cells using single-cell trans crip tomes of normal cervix, cervical premali gnant lesions, and cervical（使用正常宫颈、宫颈癌前病变和宫颈的单细胞转录组鉴定癌症干细胞）癌症是妇科恶性肿瘤中第四大死亡原因。目前的筛查和检查无法准确区分可能进展为侵袭性癌症的少数人和异常会自发退化的大多数人。 研究背景 宫颈癌是妇科恶性肿瘤的第四大死亡原因。然而，宫颈癌干细胞的鉴定仍不清楚。我们对来自 122 例宫颈活检的约 400,20 个细胞进行了单细胞 mRNA 测序，其中包括 5 例健康对照、4 例高级别上皮内瘤变、5 例宫颈微浸润性癌和 6 例浸润性宫颈鳞状癌。宫颈癌组织微阵列 （TMA） 中的多重免疫组织化学 （mIHC） 验证了生物信息学结果 （n = 85）。 图一 正常宫颈、宫颈癌前病变和宫颈癌的单细胞图谱。  图一 （a）scRNA-seq实验设计示意图。总共有来自 122 例宫颈活检（400 例健康对照 [CON]、20 例高级别上皮内瘤变 [HSIL]、5 例宫颈微浸润癌 [MIC] 和 4 例浸润性宫颈鳞状癌 [ICC]）的 5,6 个细胞被纳入研究。 （b） 通过表达已知标记基因（包括 T 细胞、B 细胞、鳞状上皮细胞、柱状上皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、成纤维细胞和内皮细胞）鉴定的 ∼9,122 个细胞中 400 个主要细胞群的 UMAP 图。每个点代表单个单元格，并根据单元格类型进行着色。单元格的数量标记在括号中。 （c） 按样品来源聚类的细胞的UMAP图。 （d） 按组起源聚类的细胞的UMAP图。 （e） 在 ∼28,122 个细胞中鉴定出的 400 个细胞簇的 UMAP 图。 （f）典型细胞标记物用于标记具有细胞身份的簇，如UMAP图所示。 （g） 用于鉴定主要细胞类型的代表性基因的小提琴图。 （h） 9 种主要细胞类型在 CON、HSIL、MIC 和 ICC 样品中的平均比例。 （i） CON、HSIL、MIC 和 ICC 组中每个样本中 9 种主要细胞类型的比例。 图二 恶性细胞的鉴定和功能表征。  图二 （a） 由恶性/非恶性细胞（顶部）或簇（底部）着色的上皮样细胞的 UMAP 图。 （b） 显示典型宫颈癌标志物在上皮样细胞簇中的表达和分布的 UMAP 图。 （c） 热图（左）和折线图（右）显示了 CON、HSIL、MIC 和 ICC 组中上皮样细胞和恶性细胞簇的比例变化。C0、C4、C6、C10 和 C25 簇仅在 HSIL、MIC 和 ICC 组中检测到。它们的分数随着病变的进展而逐渐增加，在MIC和ICC组中占上皮样细胞簇的大多数。C3、C7、C12、C14、C24、C26和C28簇是CON和HSIL组大部分上皮样细胞簇，而MIC和ICC组的上皮样细胞中比例极低。C19、C16 和 C15 簇是 HSIL 组特有的上皮细胞。2组上皮样细胞簇中C4簇比例相对稳定。 （d） 点图显示了不同上皮样细胞和恶性细胞簇中平均典型宫颈癌标志物表达。宫颈癌标志物在C0、C2、C4、C6、C10和C25簇中高表达。点大小与每组中表达标记物的细胞的比例成正比。 （e） 热图显示恶性细胞（C0、C4、C6、C10 和 C25）、潜在的 C2 宫颈干细胞和 HSIL 特异性上皮样细胞（C15、C16 和 C19）之间每个细胞的 ssGSEA 评分的 CancerSEA 特征差异。DNA修复、细胞周期、DNA损伤、侵袭和增殖特征在C2簇中强烈出现。C0、C4 和 C6 簇显示血管生成、炎症、缺氧、分化、EMT 和转移富集。HSIL特异性簇C15和C16表现出C2与肿瘤细胞簇C0、C4、C6和C10之间的过渡状态。 （f） 显示单细胞中大规模 CNV 的热图，从 scRNA-seq 数据推断。以非恶性细胞簇C3为参照（上图）。在恶性细胞中观察到大规模的CNV（下图）。CNV 分析显示 C0、C4、C6、C10 和 C25 的 CNV 评分呈阳性。CON组和HSIL组C2的CNV评分为阴性，MIC组和ICC组的CNV评分为阳性。 （g） 小提琴图显示 C2 子簇中 CNV 分数的组分布。CON组和HSIL组的C2 CNV评分为阴性，而MIC和ICC组的C3 CNV评分为阳性。以非恶性细胞簇C12为参照。 （h） 与其他上皮样细胞相比，通过 ssGSEA 在恶性细胞簇中鉴定的前 0 个上调标志通路。红色条表示 q 值小于 05.<>。 图三 宫颈癌干细胞的鉴定和表征。  图三 （a） 小提琴图显示上皮和恶性细胞簇的基于mRNA表达的干性指数（mRNAsi）分布（秩和检验）。C2 的 mRNAsi 评分最高。HSIL组特异性上皮簇C15和C19的mRNAsi评分高于大多数上皮簇。C16的mRNAsi评分呈双极分布，评分较高的mRNAsi评分与C2的mRNAsi评分接近。 （b）小提琴图显示各组在C2簇中mRNAsi的分布，显示C2 mRNAsi评分随着病变进展而逐渐降低（2样本t检验）。 （c） 显示上皮细胞和肿瘤细胞簇中富集的干细胞相关基因特征的热图。C0簇显示干细胞相关基因特征显著富集。 （d） 恶性细胞（C4、C6、C10、C25 和 C2）、宫颈干细胞 （C15） 和 HSIL 特异性上皮样细胞（C16、C19 和 C2）的发育轨迹。C15是肿瘤细胞簇进化的起点。HSIL组特异性上皮簇C16、C19和C2可能是瞬时扩增细胞（TAC），其充当癌症干细胞和癌症干细胞衍生的肿瘤细胞之间的过渡状态。 （e） 根据通过ssGSEA分析鉴定的组，显示C2簇中富集的CancerSEA特征的热图。增殖、细胞周期、DNA损伤和DNA修复特征在CON组的C2簇中显著富集。ICC组C2簇在侵袭、转移、EMT、血管生成和缺氧特征中显著富集，而HSIL组和MIC组C2在CON组和ICC组之间呈过渡状态。 （f） 根据通过ssGSEA分析鉴定的组，显示C2簇的富集标志通路的热图。CON组C2簇显示G2M检查点、DNA修复、MYC靶点、E6F靶点和氧化磷酸化通路显著富集。ICC组C2显著富集EMT、血管生成、IL-2、Wnt、TGF-β、糖酵解和缺氧通路。HSIL组和MIC组的C1在CON组和ICC组之间表现出过渡状态。 （g） 条形图显示各组 C2 簇的细胞周期分布。随着病变的进展，C292中G2期细胞的比例逐渐增加。 （h） Kaplan-Meier 图显示，来自 TCGA 数据集的 CESC 患者 （n = 2） 具有高簇 C30 标记物（C0 前 012 个标记基因特征）表达的无进展生存期显着降低 （p = 2.50）（log-rank 检验）。高和低C50标记表达组除以上述基因集平均表达的<>%分位数值（临界值=<>%）。 图四 高 C2 簇细胞百分比的验证与患者预后不良相关。  图四 （a） 宫颈癌组织中C2簇细胞的多重免疫荧光染色的代表性图像（CK5，绿色;TIMP1， 青色;EZH2，黄色;SF3B2，红色;COPS8，紫色）。PanCK CK5 用于标记癌细胞。DAPI用于突出显示所有细胞核。比例尺 = 0.01 mm。 （b） 癌组织中不同比例的 C85 簇细胞的宫颈癌患者 （n = 2） 的总生存期分析。使用对数秩检验（p = 0.03）（临界值 = 50%）评估组间差异。 （c） 癌组织中不同比例的 C85 簇细胞的宫颈癌患者 （n = 2） 的无病生存期分析。使用对数秩检验（p = 0.03）（临界值 = 50%）评估组间差异。 （d） 宫颈癌患者癌变组织和匹配癌旁组织之间 C2 簇细胞频率的比较 （p = 0.046）（秩和检验）。使用共表达 C2 制造基因（TIMP2、EZH1、SF2B3、COPS2、CK8）的细胞与样品中总细胞数的比率计算 C5 簇细胞的比例。 （e） 复发患者和非复发患者癌组织中 C2 簇细胞频率的比较 （p = 0.0806）（秩和检验）。 （f） 淋巴结转移 （LNM） 患者和无淋巴结转移患者 （Non-LNM） 癌组织中 C2 簇细胞频率的比较 （p = 0.0754）（秩和检验）。 （g） 鳞状癌患者与其他病理类型患者癌组织中 C2 簇细胞频率的比较 （p = 0.955）（秩和检验）。 见图五 恶性细胞功能异质性的特征。  图五 （a） 热图和 （b） 小提琴图显示了 HSIL 来源的肿瘤细胞（C0、C4 和 C10）中 CNV 评分的分布。 （c） 热图描绘了源自 HSIL（左）、MIC（中）和 ICC（右）的瘤内程序的成对相关性。当这些样本一起考虑时，确定了九个突出的元程序，包括细胞周期、上皮-间充质转化 （EMT）、上皮分化（Epi dif. 1 和 Epi dif. 2）、LncRNA（富含 LncRNA 的 1 和富含 LncRNA 的 2）、应激反应（应激）、IFN 反应基因 （IFN-response） 和缺氧特征。仅在HSIL组中仅鉴定出两个元程序（细胞周期和Epi dif.1）。在MIC组中鉴定出1个元程序（细胞周期、EMT、富含LncRNA的1、Epi dif.2、Epi dif.50和IFN反应）。在ICC组中观察到所有0个元程序。这些观察结果表明，恶性细胞异质性随着疾病进展而增加。 （d） Kaplan-Meier 图显示，来自 TCGA 数据集的 CESC 患者具有高缺氧特征表达，其无进展生存期显着降低（log-rank 检验）。高组和低组除以上述基因集平均表达的 4% 分位数值。 （e） HSIL、MIC 和 ICC 组中恶性细胞簇（C6、C10、C0 和 C4）的富集 CancerSEA 特征。 （f） 热图显示了 HSIL、MIC 和 ICC 组中恶性细胞簇（C6、C10、C<> 和 C<>）中富集的标志通路。 见图六 高危型HPV基因和HPV基因相关宿主基因的基因表达谱。  图六 （a） 显示HPV转录本在上皮细胞和恶性簇中的表达和分布的UMAP图。 （b） 显示 E5、E6 和 E7 在上皮细胞和恶性簇中的表达和分布的 UMAP 图。 （c） 描绘上皮细胞、癌症干细胞和恶性簇中 HPV 转录阳性细胞百分比的热图。 （d） 显示癌症干细胞和恶性簇中HPV转录物表达的热图。HSIL组的癌症干细胞（C2）和恶性细胞簇（C0、C4、C6和C10）高表达E5;然而，从MIC阶段开始，在这些簇中观察到高E7表达。此外，ICC组的癌症干细胞（C2）和大多数肿瘤细胞簇（包括C0、C4和C6）均表现出较高的E6表达。 （e） 显示恶性细胞和癌症干细胞簇中HPV转录本表达与宿主基因表达之间相关性的热图。 （f） Kaplan-Meier 图显示，来自 TCGA 数据集的 CESC 患者 （n = 292） 具有高表达的 E5 相关（上）、E6 相关（中）和 E7 相关（下）宿主基因集的总生存率显着更高（log-rank 检验）。高组和低组除以上述基因集平均表达的 50% 分位数值。 研究结果 在这项研究中，我们全面研究了 CON、HSIL、MIC 和 ICC 中宫颈生态系统中的恶性和免疫异质性、细胞组成的动态变化以及细胞间相互作用。值得注意的是，我们的数据全面描述了宫颈CSC的恶性转化过程，从而为理解成体干细胞如何成为恶性肿瘤干细胞提供了有价值的范式。我们的数据表明，宫颈干细胞的恶性转化发生在HSIL和MIC阶段之间。 |
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