|
微流控技术已经成为一项成熟的技术，为流体样品、悬浮细胞和颗粒的处理和操作提供了一个极好的工具。大约30年前，第一个微流控设备被制造出来，主要旨在使分析方法小型化，特别是用于改善分析物的分离。从那时起，器件的制造和操作变得越来越容易。使越来越多的研究人员能够设计、制造和使用微流控系统，这迅速提高了微流控技术在生命科学中广泛应用的潜力。每年都有许多新的微流控方法被报道用于观察和操纵细胞、模拟器官、检测生物标志物和许多其他研究领域。 微流控技术对生物分析程序有多种好处。显然，小型化的设备有助于处理和分析在μL至pL范围内的小样品体积。相应地，测定化合物的消耗量较低，从而降低了分析成本。在数字和液滴微流控中，样品被进一步分割成液滴。通过这种方式，创建了数千个离散的反应室，这些反应室可用于药物发现、药物测试、定向进化或单细胞分析领域的高通量筛选。由于易于使用，微滴微流控平台已被添加到生物学家的单细胞测序常规方法中，也称为微滴测序。 微流控设备使其有可能将不同的功能模块（或操作单元）集成在一个平台上，并构建微整体分析系统，正如在微流控早期所设想的那样。报道了数字和液滴微流控集成系统的优秀例子，其中几个工艺步骤在单个平台上成功实现。同样实现了分析前不同分离方法的串联耦合，例如细胞悬浮液的串联耦合。 本篇文章涵盖了微流控技术领域的最新进展和发展，在之前的文章中，我们强调了微流控芯片、包括液滴微流控在内的操作单元和微流控芯片的制造技术和材料的新发展。我们在这里选择了生物分析和诊断研究，重点是细胞外囊泡、生物标志物的检测和细胞研究。鉴于2020年由新冠病毒引起的疫情，我们还强调了用于病毒检测和相关研究的微流控方法。
微流控生物分析和诊断中的选定应用 微流控细胞操作 微流控平台允许对细胞进行有效的捕获、定位和分析。通常，由于细胞聚集体和细胞碎片，在将细胞装载到通道中的第一步中会出现问题。为了解决这一问题，Calistri等人开发了一种微流控系统，通过光学触发控制单个细胞进入通道。这在分析组织和肿瘤的情况下可能会特别有帮助，因为它需要在分析单个细胞之前完全解离细胞的步骤。一旦供应到微流控装置中，细胞就可以被捕获并暴露于化学梯度，Chen等人利用了这一点。他们对HeLa细胞进行了动态单细胞研究，并研究了钙信号传导对三种不同激动剂的响应。研究表明，更大的生物体（如秀丽隐杆线虫）也可以被捕获并暴露于具有空间、时间和强度控制的刺激下。在另一种方法中，将肿瘤切片放置在无底40孔板内，置于多孔膜上。通过多孔膜下的微通道网络实现多重药物暴露，并采用荧光活/死细胞测定法来确定治疗效果。 微流控细胞测定和细胞分选 通过分选分析悬浮细胞群体是一项常见的实验，在过去的几十年里，已经引入了许多微型荧光激活细胞分选仪。Hamza等人最近证明了一种从小鼠血液中分析循环肿瘤细胞（CTC）的实验性方法。他们将小鼠血液引入细胞分选仪中，以提取和分析CTC，同时将CTC贫化的血液重新注射到小鼠中。这促进了对肿瘤进展的长期观察和对同一小鼠数周的治疗。此外，Pritchard等人发明了一种涡流驱动的细胞分选仪，该分选仪将细胞的惯性聚焦与热蒸汽气泡相结合，用于分选荧光标记的细胞。Zhou等人引入了一种微型转运体，其中惯性聚焦与高精度声脉冲相结合。对于单细胞逆转录环介导的等温扩增（RT-LAMP）信使核糖核酸检测，Chung等人提出了一种集成的液滴分选和合并平台。不是在连续的基于液滴的工作流程中进行信使核糖核酸，这些平台将液滴生成/分选与固定液滴配对相结合，以避免设备间转移或流同步的需要（图1B）。样品和试剂都被点到存储阵列上，并通过电流体动力合并，从而允许RT-LAMP反应与荧光读数。对于25μL的典型反应体积，论证了同时进行676 scRT LAMP反应的可能性。
图1 具有多个操作单元的液滴分流平台。（A） 同步上清液分析和细胞分选的工作流程。在分裂成两个子液滴后，注入细胞毒性化学传感器并通过荧光光谱进行分析。然后可以根据荧光信号对包含细胞的另一个同步液滴进行分选并随后培养。（B） 使用Sort N′Merge平台的单细胞RT-LAMP测定示意图。产生含有RT-LAMP反应物的液滴和具有裂解缓冲液的单细胞，并将其分选到存储装置中，并填充配对合并。成对的液滴通过电流体动力合并，从而允许RT-LAMP反应，然后进行基于成像的荧光测量。 其他细胞仪应用需要采集和分析图像，这在商业细胞仪中是不可能的。Isozaki等人解决了高速图像分析的这一挑战，他们展示了快速智能图像激活细胞分选，而Yalikun等人强调了可变形通道壁对基于图像的细胞术的影响。Sesen和Whyte进一步引入了液滴中基于图像的细胞分选。 微流控分泌化合物的分析 微流控技术还特别改进了细胞分泌化合物的分析，因为它们可以积聚在微制造的隔间或液滴中。最近，引入了一种用于基于活性的抗体筛选和测序的高通量单细胞平台。其针对分泌lgG的原代细胞来表征针对可溶性或膜抗原的抗体结合特性。因此，需要两种工作流程，均采用基于液滴内荧光信号的空间分布的单细胞划分和分选。 化学传感器可能对细胞有害，并可能诱导表型变化，尤其是对干细胞。为了克服这一瓶颈，最近提出了一种基于液滴的平台，该平台可以拆分单细胞液滴进行分泌分析（图1A）。首先将单个干细胞包封到液滴中并产生白蛋白。在分裂液滴后，将细胞毒性白蛋白传感器添加到没有细胞的子液滴中，并通过荧光光谱进行分析。此外，Hsu等人将水凝胶传感器与靶细胞一起嵌入水滴中。在培养和产生细胞因子后，对液滴进行乳化处理，并通过免疫测定分析载有细胞因子的水凝胶传感器。通过水凝胶传感器的加热和收缩实现了进一步的信号增强。代替液滴、孔或瓣膜定义的微室也可用于分泌物研究。细胞因子的定量，有助于评估免疫反应，是在带有集成生物传感器的多孔微流控平台上实现的。最近，报道了CTC的分离效率超过95%，并对其蛋白质分泌进行了定量。在CTC的大小选择性捕获后，通过基于磁珠的检测法测定粒细胞生长刺激因子的分泌水平，LOD为1.5 ng mL–1。 微流控诊断应用程序 血细胞分离 许多诊断方法使用液体活组织检查，即血液取样和分析。微流控技术在该过程中是有益的，因为它们可以用于分离血液成分，如红细胞和白细胞、血小板或脂质颗粒，或捕获特定类型的靶细胞，如CTC。例如，确定性横向位移（DLD）可用于按大小分离血细胞、血小板和掺入的稀有细胞。在两步过程中实现了更有效的分离，其中第一分离步骤基于螺旋惯性微流控，第二步骤使用DLD。DLD阵列中的尖锐边缘使通过的细胞变形，其可用于可变形性研究，并通过可变形性分离。Kim等人介绍了一种在60μL min–1的高流速下一步纯化白细胞（WBC）的方法。它协同结合了一个倾斜阵列的WBC富集单元作为通量增强器和一个倾斜的、不对称的WBC洗涤单元作为纯度增强器。在类似的背景下，朱等人构建了一个用于快速提取白细胞的惯性微流控立方体。Tohner及其同事最近报道了一种用于从血液样本中捕获CTC的高度集成设备。它在单个平台上结合了惯性聚焦、微流控过滤器结构和磁性分选。 在旋转圆盘上执行用于分析血液的另一种方法。它利用密度梯度离心进行全血计数，与自动血液分析仪相比，准确度>95%。 用于检测生物标志物的临床微流控设备 微流控技术是临床应用或分散测试的理想选择，得益于其占地面积和便携性。介绍了一种可穿戴液滴微流控系统，用于组织生物化学的实时采样和测量。螺杆驱动的蠕动泵同时将灌注液送入微透析探针，并将所得透析液提取到装置中。随后立即将样品-试剂混合物分割成液滴，用于基于吸光度的葡萄糖和乳酸测量。使用具有梯度孔径的3D微孔中空纤维膜来捕获细胞并允许较小分子的扩散。只需要5μL的少量样品，并通过毛细管力给药。通过将不同的分析试剂固定在膜框架上，可以检测到葡萄糖等生物分子。
图2 用于临床诊断的便携式微流控设备。（A） 螺杆驱动的蠕动泵同时将灌注液送入微透析探针，并将所得透析液提取到装置中。然后在液滴形成和分析（例如葡萄糖）之前将透析液与试剂混合。结果通过蓝牙传输到外部设备。（B）表皮微流控汗液传感器的概述，允许对肌酸酐和尿素进行定量比色分析，这是肾脏疾病的相关生物标志物。 此外，开发了一种三层分层结构的微流控芯片，以量化具有动态检测范围的多种生物标志物。通过控制捕获抗体浓度并因此控制化学发光读出信号的强度来调节检测范围。对于同时分析的三个靶标之一的C反应蛋白，他们报告的动态范围为3.13–100 mg L–1，LOD为1.87μg mL–1。此外，Shin等人展示了一种用于基于自主适体的分子检测的集成微流控设备。该设备接受全血样本，将全血样本与试剂一起引入芯片。将血细胞通过水刺法移到真空柱上。血浆到达腔室，在腔室中检测到标志物凝血酶。为了对与肾脏疾病相关的生物标志物进行比色分析，提出了一种较温和的微流控系统（图2B）。它非常有吸引力，因为它是被动收集汗液，无创且易于患者使用。此外，这种应用于表皮的设备可以通过适当的比色测定法检测生理相关水平的肌酸酐和尿素。此外，对供体肾脏的生存能力评估可以改善移植的结果。因此，开发了一种便携式微透析液实时分析平台来监测组织代谢产物。基于针头的生物传感器检测葡萄糖和乳酸，并通过蓝牙将数据传输到智能手机应用程序。 Cunningham及其同事开发了一种可主动捕获和数字计数分析的自供电微流控设备，通过免疫分析检测蛋白质生物标志物。除了便携性之外，该方法的灵敏度对于检测低浓度生物标志物也是重要的。Tokeshi及其同事提出了对疾病生物标志物非常敏感的免疫测定法，其中捕获抗体固定在通道壁上，以提高检测极限。 细胞外囊泡（EV） 分子生物学中EV指细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs），按照生物合成机制的不同，目前至少发现了两种EV，即细胞外泌体和sMV。sMV也经常被称作超微小泡（microvesicle）、核外颗粒体（ectosome）和微粒（microparticle）。我们主要根据大小来区分细胞外泌体和sMV。外泌体的直径约为30~150 nm，而sMV的直径则在50~1300 nm。而且，这两种EV大小可能会有重叠。值得注意的是，某些EV的大小还会受储存条件的影响。 细胞分泌的外泌体被认为是诊断各种疾病的有价值的生物标志物，如癌症，以及潜在的药物递送载体。它们含有来源细胞的表面标记物、蛋白质和RNA，并且很容易通过液体活检获得，因为它们存在于血液、尿液和唾液中。然而，EVs必须从这些体液中富集和分离，以进行进一步分析。Nagrath及其同事利用一种与两种黑色素瘤特异性抗体MCAM和MCSP结合的微型设备，从全血中捕获黑色素瘤细胞周期蛋白肿瘤细胞和外泌体。通过结合光学沉积物的原位酶促扩增和表面等离子体共振，从被诊断为阿尔茨海默病的患者的血液样本中分析外泌体群体。与其他此类平台相比，优化了几个参数，实现了高度灵敏的多路检测。Mathew等人在微流控装置中开发了一种前列腺癌症细胞系EV测定法，通过结合纳米叉指状电极上的氧化还原循环、酶反应和三明治免疫测定，能够检测全血中发生的相同EV浓度范围。另一组提出了一种前列腺癌症诊断技术，通过使用分子信标和抗体原位检测外泌体miRNA和表面蛋白。 刘等人使用热泳法富集用荧光标记的细胞外囊泡，并通过线性判别分析算法对其进行分类。因此，获得了232份血清样品中EVs的表面蛋白图谱，发现了6种I至IV期癌症类型，对I期癌症的敏感性为95%。通过用DNA适体标记EV，然后用λ-DNA介导的粘弹性微流控标记EV，基于微流控共流装置中的尺寸和标记物表达在2D中分析单个EV。因此，可以使用算法分析具有不同HER2表达的乳腺细胞系和癌症患者的EV亚群。 分离纳米尺寸的颗粒一直是一个巨大的挑战。几位研究人员开发了微流控技术，有效地克服了这些困难。例如，Zhang和Lyden提供了不对称流场流动分级（AF4）的详细方案，适用于分离和进一步表征细胞外囊泡，如外泌体。集成到底壁中的半容许膜允许过滤低于截止尺寸的纳米颗粒。具有较大颗粒范围的样品可以仅由于其扩散系数的差异而被分离。因此，AF4提供了一种无标记、温和和快速的方法，可以在1小时内以1 nm的分辨率分离细胞外纳米颗粒。此外，将纳米颗粒跟踪分析与AF4相结合，能够在线分离和计数50至200 nm大小的聚苯乙烯颗粒。 微流控病原菌鉴定及耐药性检测 快速检测病原体的抗生素敏感性可以帮助医生选择治疗细菌感染的最佳药物混合物。比如有一种能够同时筛选四种细菌/药物组合的新设备，通过并行化测试可以提高吞吐量。细菌细胞包封后，将液滴转移到四个集成的微滴阵列中。每个阵列都有8000多个对接点，在这些对接点中对扩散进行了评估。与传统方法的16-24小时相比，其30分钟的测定时间明显更快。另一种微流控设备允许在单细胞水平上进行快速分类和易感性测试，其中病原体通过毛细管力加载到通道中。这些能力在临床样本中得到了展示，在大约30分钟内测试抗生素反应中，根据大小和形状识别病原体。此外，Coudron等人开发了一个用于自动免疫测定的数字微流控平台，利用全磁分离过程进行快速检测。该设备与电润湿耦合空气采样器兼容，并在6至10分钟内完成自动免疫测定。为了研究微生物群落的种间相互作用和环境依赖性，提出了一种液滴微流控芯片，其中颜色编码的种液滴在微孔中随机合并。通过荧光蛋白表达和呼吸驱动的刃天青还原进行表型分析。这个所谓的kChip被用来筛选100 000个多物种群落，包括多达19个土壤微生物分离株，以确定促进模式植物共生体生长的集合（图3B）。
图3 囊泡和液滴的高度平行分析。（A） 用于测试膜活性药物对单个脂质囊泡疗效的微流控平台。该平台由囊泡形成模块和8个单独的腔室组成，每个腔室包含372个囊泡陷阱的阵列。通过荧光成像进行评价。（B） 通过合并液滴大规模并行构建和筛选微生物群落。液滴的含量以颜色代码为特征。群落表型可以通过光学测定进行跟踪，包括荧光蛋白表达和呼吸驱动的雷沙祖林还原为荧光产物试卤灵。 一类新的有前景的抗菌药物是多肽，它具有膜溶解特性。为了估计这些特性，开发了一个在分离室中产生和捕获脂质囊泡的平台。将染料填充的囊泡连续暴露于不同浓度的抗菌剂Cecropin B中，并且可以通过荧光强度的降低来估计时间依赖性效应（图3A）。 微流控病毒检测 2020年由新冠病毒引起的疫情表明了敏感、快速和廉价的病毒检测方法及其可用性的重要性。最近的几项研究表明，微流控技术可以对需求做出重大贡献。Ackerman等人开发了一种基于CRISPR的多路复用平台，用于检测多达169种人类相关病毒。平台的小型化将试剂成本降低了300倍，使其能够负担得起患者样本的高通量和宽覆盖测试。建立一个高度灵敏和快速的基于CRISPR的平台，从样本到检出的检测时间约为50分钟。与此同时，Lin等人使用抗原与荧光读数相结合，以实现小于15分钟的检测时间。PRESCIENT平台位于用于快速检测病毒中和抗体的集成微流控平台中。在单细胞水平上进行病毒对抗体的易感性。抑制病毒传播的另一种方法是破坏病毒的生命周期。病毒外壳包裹病毒遗传物质的蛋白质，通过多循环电阻脉冲传感平台进行了研究。病毒颗粒通过四个连续的纳米孔来回驱动，每次都给出检测信号。病毒颗粒通过纳米孔之间的时间与病毒颗粒的大小相关。这种方法可以在一个时间差内区分病毒颗粒大小，并为研究病毒自组装过程提供了强有力的工具。 特别是在全球疫情中，最重要的是可以在现场快速进行病毒检测，优先在POC设备上进行。因此，Hedde等人开发了一个模块化微阵列成像平台，用于高度选择性和特异性检测病毒，如新冠病毒。他们开发的平台显示出与常用的读板器相似的灵敏度，但价格低100倍。McRae等人开发的另一种临床设备能够定义患者病程的严重程度，从而促进临床环境中的决策。姜等人开发了一种用于病毒检测的微流控POC平台，该平台提供用于病毒裂解和RNA提取的试剂的存储和递送。与不需要任何实验室设备的市售提取试剂盒相比，该系统在RNA富集方面实现了类似的灵敏度水平。此外，越来越多的POC设备使用智能手机作为用户界面。开发了一种被动和自驱动的微流控平台，该平台能够通过集成的比色传感器实现高灵敏度的读数。结果会自动发送到连接的智能手机。此外，Minagawa等人开发了一个用于流感病毒数字检测的成像平台。最近，一种自主POC设备被报道用于在全血中快速检测HIV。它利用了一种新的RT-LAMP测定法，其试剂可以在较为干燥的室温下储存3周。扩增后，通过侧流免疫测定法对产物进行可视化，每个反应的灵敏度为3×105个病毒拷贝。 结论与展望 由于微流控占地面积小且具有集成的可能性，微流控平台是临床上进行诊断测量的宝贵工具。这可以取代对设备齐全的实验室的需求，并提供支持患者选择治疗方法的快速检测结果，例如，选择抗生素治疗感染，以及进行疾病监测以评估所选择的治疗方法。临床设备应非常坚固且易于使用，以便排除用户错误。同样，结果应该是清晰可见的，并基于简单的分析方法，例如比色测定或智能手机辅助检测。然而，在低资源环境中广泛商业化和使用变得可行之前，仍然需要进行重大优化。对病毒感染快速检测的迫切需求将积极推动研究，以提高稳健性和再现性，以及简单、用户友好的操作。 微流控的跨学科性质需要来自不同背景和具有不同专业知识的研究人员的协同努力。近年来，这种合作越来越成功，微流控在生命科学中的接受度越来越高，必将在不久的将来推动当前的趋势。 |
|
|
