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大家好，今天给大家解读一篇题：Iron drives anabolic meta bolism through active histone demeth ylation and mTORC1 (铁通过活性组蛋白去甲基化和mTORC1驱动合成代谢) Jmi-C KDM属于依赖于Fe2+和αKG的双加氧酶大家族，通过其对组蛋白去甲基化的作用而发挥基因转录的关键调节作用。 01 研究背景 所有真核细胞都需要最低限度的铁阈值来维持合成代谢。然而，细胞感知铁以调节合成代谢过程的机制尚不清楚。在这里，我们报告了一种以前未描述的铁传感真核途径，其中需要分子铁来维持活性组蛋白去甲基化并维持促合成代谢 mTORC1 途径的关键成分的表达。具体来说，我们将铁结合组蛋白去甲基化酶 KDM3B 鉴定为一种通过去甲基化 H3K9me 来调节 mTORC1 活性的内在铁传感器2在高亲和力亮氨酸转运蛋白 LAT3 和 RPTOR 的增强子处。通过直接抑制亮氨酸可用性和 RAPTOR 水平，缺铁会取代其他营养物质输入到 mTORC1 中。 见图一 长期 ID 使多种细胞类型的 mTORC1 失活。  图一 （A） 用 150 μM DFO 处理的HEK293T细胞中的非血红素铁水平。（n = 5 次重复，双向非配对 t 检验，平均值 ± s.e.m.）。 （B） 用 150 μM DFO 处理的 HEK293T 细胞中指定时间点的 TTP 和 TFRC 的 mRNA 水平。内部对照：POLR2A（n = 每个条件 6 次重复，单因素方差分析和 Tukey 事后检验，平均值 ± s.e.m.）。 （C） 用指定浓度的 DFO 处理的HEK293T细胞中 mTORC1 活性的免疫印迹。两个独立实验的代表性图像 。 （D） 用 150 μM DFO 或 50 μM BPD 处理 3 小时的HEK293T细胞中 mTORC1 活性的免疫印迹。两个独立实验的代表性图像。 （E） 加入 150 μM DFO 或 50 μM BPD 后 3 小时指示基因的 mRNA 水平。内部对照：POLR2A（n = 8 TFRC对照;n = 7 TFRC 150 μM DFO和50 μM BPD;n = 4 REDD1;n = 8 TTP重复每个条件，单因素方差分析和Tukey事后检验，平均值± s.e.m.）。 （F） 在指定时间点响应 250 nM Torin1 的 mTORC1 活性的免疫印迹。两个独立实验的代表性图像。 （G） 用浓度递增的 DFO 处理的原代小鼠肝细胞中 mTORC1 活性的免疫印迹。用指定浓度的 DFO 处理的原代小鼠肝细胞中 Ttp 和 Tfrc 的两个独立实验 （H） mRNA 的代表性图像。内部对照：Polr2a（n = 每个条件 3 次重复，单因素方差分析和 Tukey 事后检验，平均值 ± s.e.m.）。 （I） 用 150 μM DFO 处理的 hPS-CM 中 mTORC1 活性的免疫印迹。一个实验的代表性图像 （J） 用 150 μM DFO 处理的 hiPS 神经元中 mTORC1 活性的免疫印迹。一个实验的代表性图像。 （K） 螯合 18 小时的 HEK293T 细胞的免疫印迹，然后加入柠檬酸铁铵 （FAC） 指定时间。两个独立实验的代表性图像。 （L） BrdU掺入用150μM DFO处理的HEK293T细胞中。六个独立样本的代表性图像。 （M） 用 DFO 处理 48 小时后通过 Hoescht 染色定量细胞增殖（n = 6 次重复，双向非配对 t 检验，平均值 ± s.e.m.）。* 表示所有面板的 P 值< 0.05。源数据文件中提供了源数值数据和未处理的印迹。 见图二 诱导 ID 灭活 mTORC1 的非药物方法。  图二 （A） 用高 Tf-sat （66%） 或低 Tf-sat （6.6%） 培养基处理 18 小时的HEK293T细胞中 mTORC1 活性的免疫印迹。两个独立实验的代表性图像。 （B） 图 A 中免疫印迹的总结（n = 3 次重复，双向非配对 t 检验，平均值 ± s.e.m.）。 （C） 在存在和不存在 500 ng/ml 多西环素的情况下，用 FPN-GFP 融合蛋白和 TET 诱导型 rtTA3 质粒转染的 HepG2 细胞中 mTORC1 活性的免疫印迹 48 小时。两个独立实验的代表性图像。 （D） 图 C 中免疫印迹的总结（n = 3 次重复，双向非配对 t 检验，平均值 ± s.e.m.）。 （E） 用 FPN-GFP 构建体转染并用 500 ng/ml 多西环素处理 24 小时的细胞的荧光显微镜检查显示 FPN-GFP 融合蛋白的适当表达和定位。三个独立样品的代表性图像。 （F） 在存在和不存在 500 ng/ml 多西环素的情况下，在 rtTA3/FPN-GFP 稳定HEK293T细胞中掺入嘌呤霉素的免疫印迹 48 小时。一个实验的代表性图像。 （G） 用 rtTA3/FPN-GFP 质粒转染并用 500 ng/ml 多西环素处理 48 小时的 HepG2 细胞中内质网应激产物 CHOP 和 BNIP3 的 mRNA 表达。内部对照：18S（n = 4 次重复，双向非配对 t 检验，平均值 ± s.e.m.）。 （H） 在 HEK293T 细胞中 150 μM DFO 24 小时后对 mTORC1 复合物关键成分的蛋白质水平进行免疫印迹。两个独立实验的代表性图像。 （I） 图 A 中显示的结果摘要（n = 4 次重复，双向非配对 t 检验，平均值 ± s.e.m.）。 （J） 在HEK293T细胞中用 150 μM DFO 处理后，在不同时间点对总蛋白和磷酸化 TSC2、AKT、ERK、GSK3β 和 S6 蛋白以及总 P53 进行免疫印迹。一个实验的代表性图像。 （K） 在指定剂量下用 DFO 处理 18 小时的 HepG2 细胞中 mTORC1 活性和线粒体功能的免疫印迹。一个实验的代表性图像。 （L） 在以指定剂量处理 24 小时 DFO 的 HepG2 细胞中，通过海马测定法测量的耗氧率 （OCR）（n = 每组 10 次重复，平均值 ± s.e.m.）。 见图三 ID 灭活 mTORC1 需要亮氨酸感应。  图三 （A） 用 150 μM DFO 处理的 WT 和 Tsc2 KO MEF 中的 Ttp mRNA。内部对照：Snrk（n = 每个条件 4 次重复，单因素方差分析和 Tukey 事后检验，平均值 ± s.e.m.）。 （B） WT 和 Tsc2 KO MEF 中 mTORC1 活性的免疫印迹，并进行了指定治疗。三个独立实验的代表性图像。 （C） 用 si REDD1 处理的 HEK293T 细胞中的 REDD1 mRNA。内部对照：POL2RA（n = 每个条件 6 次重复，双向非配对 t 检验，平均值 ± s.e.m.）。 （D） 用 siREDD1 和 150 μM DFO 处理的HEK293T细胞中的 TFRC mRNA。内部对照：POL2RA（n = 每个条件 6 次重复，单因素方差分析和 Tukey 事后检验，平均值 ± s.e.m.）。 （E） 指定治疗下 mTORC1 和 AMPK 活性的免疫印迹。用 150 μM DFO 处理的 WT 和 Ampkα1/2 dKO 细胞中一个实验 。 （F） Ttp mRNA 的代表性图像。内部对照：Polr2a（n = 每个条件 4 次重复，单因素方差分析和 Tukey 事后检验，平均值 ± s.e.m.）。 （G） 用 150 μM DFO 处理的 HEK293T 细胞中的吖啶橙染色。六个独立样本的代表性图像。 （H）图G中的结果摘要（n = 7重复对照;n = 6 150μM DFO，双向非配对t检验，平均值±s.e.m.）。 （I）用150μM DFO处理的HEK293T细胞中的亮氨酸水平（n = 5次重复对照;n = 4 150μM DFO双向非配对t检验，中位数±四分位数）。 （J）用150μM DFO处理的HEK293T细胞中的SAM水平（n = 5次重复对照;n = 4 150μM DFO，双向非配对t检验，中位数±四分位数）。 （K） WT 和 NPRL2 KO 细胞中 mTORC1 活性的免疫印迹HEK293T指定处理。一个实验的代表性图像。 （L） mTORC1 定位于用 150 μM DFO 处理的 NPRL2 KO 细胞中的溶酶体。六个独立样本的代表性图像。 （M）图L中图像的定量（n = 5重复对照;n = 6 150μM DFO，双向不配对t检验，平均值±s.e.m.）（N） 在用 150 μM DFO 处理指定时间的 WT 和 NPRL2 KO HEK293T细胞中使用 Hoescht 和碘化丙啶 （PI） 进行细胞死亡。六个独立样本的代表性图像。 （O） 图N中图像的量化。（n = 6 次重复，双向非配对 t 检验，平均值 ± s.e.m.）。 见图四 ID 增加 H3K9 二甲基化，与 ATF4、IRP 系统和 2-HG 无关。  图四 （A） H3K9me的免疫印迹2在用150μM DFO处理的hiPS-CM中。一个实验的代表性图像。 （B） H3K9me的免疫印迹2在用 150 μM DFO 处理的 hiPS 神经元中。一个实验的代表性图像。 （C） H3K9me的免疫印迹2具有指定治疗的 MEF 中的水平。两个独立实验的代表性图像。 （D、E）图 C 中免疫印迹的总结（n = 3 次重复，单因素方差分析和 Tukey 事后检验，平均值 ± s.e.m.）。 （F） H3K9me的免疫印迹2在表达 rtTA3/GFP-FPN 的 HepG2 细胞中，并进行了指定治疗。两个独立实验的代表性图像。 （G） 用 150 μM DFO 处理的 WT 和 Arnt KO MEF 中指示基因的 mRNA。内部对照：18S（n = 每个条件 4 次重复，单因素方差分析和 Tukey 事后检验，平均值 ± s.e.m.）。 （H） H3K9me的免疫印迹2WT 和 Atf4 KO MEF 的水平，并有指示的治疗。一个实验的代表性图像。 （I） 图 H 中免疫印迹的总结（n = 每种条件 3 次重复，单因素方差分析和 Tukey 事后检验，平均值 ± s.e.m.）。 （J） H3K9me的免疫印迹2WT 和 Irp1/2 KD/KO MEF 的水平，并有指示的治疗。两个独立实验的代表性图像。 （K） 图 J 中免疫印迹的总结（n = 每个条件 3 次重复，单因素方差分析和 Tukey 事后检验，平均值 ± s.e.m.）。（L） 用指定 siRNA 处理的 Irp2 KO MEF 中 IRP1 水平的免疫印迹。一个实验的代表性图像。 （M） 图 L 中免疫印迹的总结（n = 每个条件 3 次重复，双向非配对 t 检验，平均值 ± s.e.m.）。 （N） 用 150 μM DFO 处理的 WT 和 Irp1/2 KD/KO MEF 中指示基因的 mRNA。内部对照：Snrk（n = 每个条件 6 次重复，单因素方差分析和 Tukey 事后检验，平均值 ± s.e.m.）。 （O）处理150μM DFO的HEK293T细胞中2-HG /琥珀酸水平的比率（n = 5次重复对照;n = 4 150μM DFO，双向非配对t检验，中位数±四分位数）。 （P） H3K9me的免疫印迹2在具有指定治疗的HEK293T细胞中。一个实验的代表性图像。 （Q） H3K9me的免疫印迹2在具有指定治疗的HEK293T细胞中。一个实验的代表性图像。 见图五 ID 改变了 POLR2A 在参与代谢途径的基因启动子上的占有率。  图五 （A） 启动子和基因体预定义区域内 POLR2A 占有率的倍数变化，以对由 POLR2A 结合增加、POLR2A 丢失和启动子暂停定义的基因进行分类。 （B） ID 后 POLR2A 组中富集的基因的基因本体 （GO） 项。 （C） ID 后 POLR2A 降低的基因的 GO 项。 （D） LAT3（顶部）和 PAT1（底部）基因位点的 UCSC 基因组浏览器跟踪。加载来自 ChIP-seq 分析的 POLR2A 和 H3K9me2 轨迹，并表示为 DFO 组和对照组之间归一化读长的差异。H3K9me地区2DFO组中的富集用红色下划线标出。转录方向由黑色箭头指示。编码组蛋白（LAT3 和 PAT1）和 Genehancer （PAT1） 浏览器轨迹显示在下方，代表预测的增强子区域，这些区域与增加的 H3K9me 区域一致2响应 DFO 的信号。黄色条、红色和灰色箭头表示由 Encode Histone 和 Genehancer 浏览器轨迹指定的增强子区域。 见图六 ID 增加 RPTOR 启动子内的 H3K9 二甲基化，并与 RPTOR 表达降低相关。  图六 （A） H3K9me2来自 ChIP-Seq 分析的 RPTOR 启动子中的信号和 POL2RA 占有率。 （B） HEK293T细胞中 RPTOR 的 ChIP-PCR。用 150 μM DFO 或 250 μM IOX1 处理 12 小时的细胞和载体对照，然后使用抗 H3K9me 的抗体对裂解物进行 IP2.IgG 用作 IP 的阴性对照（n = 2 次重复）。 （C） 加入 150 μM DFO 后指定时间点的 RPTOR mRNA 水平。样品与图相匹配。4I. 内部对照：POLR2A（n = 每个条件 4 次重复，单因素方差分析和 Tukey 事后检验，平均值 ± s.e.m.）。 （D） 在指定时间点用 100 μg/ml 环己酰亚胺 （CHX） 处理的HEK293T细胞中 RPTOR、mTOR 和 HIF1-α 水平的免疫印迹。HIF1-α在常氧条件下通过EGLN和Von-Hippel Lindau（VHL）蛋白的作用迅速翻转，用作阳性对照。一个实验的代表性图像。 （E） 用 150 μM DFO 处理 48 小时后 A549 细胞中 mTORC1 活性和复合物成员 RAPTOR 的免疫印迹。两个独立实验的代表性图像。 （F） 用 150 μM DFO 处理的患者来源的原发性肿瘤细胞培养物中 mTORC1 活性和复合物 RAPTOR 的免疫印迹。一个实验的代表性图像。 （G） 组 （F） 中免疫印迹的定量（n = 3 次重复，单因素方差分析和 Tukey 事后检验，平均值 ± s.e.m.）。（H） 对用 FLAG-RAP2A 或 FLAG-mTOR 转染并用或不用 150 μM DFO 处理 48 小时的细胞裂解物进行免疫印迹。使用抗 FLAG 抗体进行免疫沉淀。RAP2A = 阴性对照。 （I） 图 （H） 的 IP 研究摘要（n = 3 次重复，双向非配对 t 检验，平均值 ± s.e.m.）。两个独立实验的代表性图像 （J） WT 和 NPRL2 KO 中 mTORC1 活性的免疫印迹 HEK293T 用和不用 150 μM DFO 处理 48 小时。一个实验的代表性图像。 （K） 面板 （J） 中免疫印迹的定量（n = 3 次重复，单因素方差分析和 Tukey 事后检验，平均值 ± s.e.m.）。 见图七 Jumonji-C KDM 家族抑制剂 IOX1 模拟 ID 对 mTORC1 活性的作用。  图七 （A） 用各种 Jmj-C 结构域抑制剂处理 12 小时的 HEK293T 细胞中 AA 转运蛋白、RPTOR 和 TTP 的 RT-PCR。内部对照：POLR2A（每个条件n = 4次重复;n = 3 TTP 1 mM DMOG除外，双向非配对t检验，平均值± s.e.m.）。 （B） mTORC1 活性和 H3K9me 的免疫印迹2用 150 μM DFO 或 250 μM IOX1 处理 18 小时的 A549 细胞中的水平。两个独立实验的代表性图像。 （C） 用 250 μM IOX1 处理 48 小时的 A549 细胞中指示蛋白的免疫印迹。两个独立实验的代表性图像。 （D） 用 250 μM IOX1 处理 12 小时的 HepG2 细胞的胞质溶胶和膜组分的免疫印迹。一个实验的代表性图像。 （E） 图 D 中数据的密度测定摘要（n = 每个条件 3 次重复，双向非配对 t 检验，平均值 ± s.e.m.）。 （F） 14用 150 μM DFO 或 100 μM IOX1 处理 18 小时的 HEK293T 细胞中摄取 C-亮氨酸（n = 每个条件 5 次重复，单因素方差分析和 Tukey 事后检验，平均值 ± s.e.m.）。 （G） 14将 C-亮氨酸摄取到 HeLa 细胞中，用 150 μM DFO 或 100 μM IOX1 处理 18 小时（n = 每个条件 4 次重复，单因素方差分析和 Tukey 事后检验，平均值 ± s.em.）。CPM = 每分钟计数。 （H） 用 250 μM IOX1 处理 18 小时的 mTORC1 活性 WT 和 NPRL2 KO HEK293T 细胞的免疫印迹。两个独立实验的代表性图像 。 （I） 图 H 中免疫印迹的定量（n = 每组 3 次重复，使用 Tukey 事后检验进行单因素方差分析±。 02 研究结论 该过程发生在体内，不是典型铁利用途径的间接影响。由于祖先真核生物具有 KDM 和 mTORC1 核心成分的同源物，因此该途径可能早于 mTORC1 的其他王国特异性营养传感器的出现。 好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。 |
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