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一、单细胞数据处理方法-Seurat方法
目前，分析单细胞的工具越来越多。其中，Seurat是一个集大成的R包，包含了各种处理单细胞的方法。在R语言中，它使用了S4编程技巧。在单细胞数据分析中，Seurat使用也是最多的，理解其构建的单细胞数据结构成为分析单细胞数据的重要基础（这是在你使用Seurat包时，否则，请忽略！）。
二、Seurat对象的结构 Seurat变量是一种S4对象结构，在初次构建一个对象时，其基本的结构如下（示例）。 # 创建Seurat对象> ZSR.N <- CreateSeuratObject(ZSR.N, min.cells = 3)
Seurat对象的主要属性解读： （1）assays属性 该属性主要存储了所有细胞的UMI原始数据和标准化数据。在初次构建对象时，也存在相应的属性，只是属性值要么是空，要么和原始数据保持一致。默认情况下，我们是对Seurat中的RNA的Assay进行操作。可以通过@active.assay查看当前默认的assay，通过DefaultAssay()更改当前的默认assay。
RNA是assary访问的第一个属性值，包含了以下所有的属性值 counts：包含了所有细胞的原始UMI数量矩阵，一种稀疏矩阵 data：在初次构建Seurat时，与counts保持一致；当使用NormalizeData()函数标准化后，修改为该方法标准化后的值；主要用于差异分析等 scale.data：初次构建时，大小为0；当使用ScaleData()函数表表转化后，修改为该方法标准化的值；主要用于PCA，UMAP，t-SNE等数据分析等 var.features：用于存放高变异的基因名，默认情况下为空。我们可以用函数VaribleFeatures()来获得这个向量。 meta.features：对每个 features 做的注释。如果要对 features 的功能进行注释、打分、筛选都需要用到meta.features。
（2）meta.data属性
描述每个细胞信息的元数据，每一行代表一个细胞，每一列代表细胞的属性。默认情况下，主要包括orig.ident, nCount_RNA, nFeature_RNA等属性。在后续进行部分运算时，比如线粒体，红细胞等百分比，不同分辨率下的细胞聚类等信息等，也会保存在该属性下。
orig.ident：一般保存的是该对象中所有细胞的样本来源，或者根据自己的需求更改为对细胞的注释。 nCount_RNA：每个细胞的总鉴定的UMI数量 nFeature_RNA：每个细胞的总鉴定的基因数量 meta.data可以用于细胞的筛选或过滤（依据细胞的属性和类型对细胞进行筛选）。 meta.data也可以把分析得到的结果，保存到mata.data中，比如线粒体的比例，红细胞的比例等
（3）active.assay属性：表示后续分析过程中，使用的数据矩阵；可以通过 active.assay属性，查询当前默认激活的assay对象，也可以用 DefaultAssay()函数设置激活的 assay对象。 （4）active.ident属性：表示每一个细胞所属的细胞类型。细胞类型可能有多种不同的分类方法，有些是自动注释的结果，有些可能是手动注释的结果。但在某一时刻激活的细胞类型注释方法是不同的。可以通过用active.ident属性来查询当前默认的细胞类型。
（5）reductions属性：是一个列表对象，包含了一个或多个 DimReduc obect 对象。每一个 DimReduc object 对象对应一种降维分析结果，比如PCA, UMAP, t-SNE等。 （6）commands属性：保存操作该对象的命令及参数
三、NormalizeData和ScaleData两种标准化方法的区别
原始数据如下格式，点号代表没有表达（为0值）：行是基因，列是细胞 > ZSR.N@assays$RNA@data[1020:1030, 100:103]11 x 4 sparse Matrix of class "dgCMatrix" ZSRN_ACCAGTAGTTCGAATC ZSRN_ACCCACTAGTTAACGA ZSRN_ACCCACTCAGGTTTCA ZSRN_ACCCACTTCGTGGACCSETDB1 . . . .CERS2 . . . .MINDY1 . . . .PRUNE1 . . . .BNIPL . . 2 .C1orf56 . . . .CDC42SE1 1 . 1 .MLLT11 . . . .GABPB2 . . . .SEMA6C . . . .TNFAIP8L2 . . . .
2.1 NormalizeData()函数
该标准化方法是用来去除由于测序深度带来的影响，后续对方法进行了优化，形成了一个新的标准化方法-SCTransform标准化方法。
基本原理是以细胞为单位，对该细胞中鉴定到的所有基因的counts求和，再将该细胞中每一个基因的counts除以和，再乘以一个因子（默认1000），最后，对所有值取log10变换。
主要用于差异分析，高可变基因等分析
# 以BNIPL基因为例，在ZSRN_ACCCACTCAGGTTTCA细胞中为 2# 计算ZSRN_ACCCACTCAGGTTTCA（第三列）的总counts数total <- sum(pbmc@assays[["RNA"]]@counts[,2])# 计算标准化后的值log1p(2/total*10000)
2.2 ScaleData()函数
该方法的基本原理是以基因为单位，对基因进行z-score标准化，主要用于PCA, UMAP, t-SNE等降维分析。
#统计 BINPL 基因在所有细胞中平均表达均值mean(pbmc@assays$RNA@data['BINPL',])#[out]:0.05966781
#统计 BINPL 在所有细胞中表达标准差sd(pbmc@assays$RNA@data['BINPL',])#[out]:0.3216486
# z-score计算(1.625141-0.05966781)/0.3216486
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