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细胞外囊泡（MV）是纳米和微米大小的膜封闭囊泡，其携带着细胞中的各种生物分子，参与到各种生理和病理过程中。对MV进行检测可以对癌症的分类和发展状态进行指示。在现有的MV分离方法中，包括超速离心、过滤和免疫亲和捕获等。这些方法存在着分离产量低、分离纯度差、完整性差的问题。因此本研究开发了一种用于MV蛋白检测的模特一行分离和两步级联扩增策略（MESS2CAN）。 MESS2CAN中包括四个步骤：（1）样本采集；（2）分离；（3）放大；（4）检测（图1）。首先利用生物素修饰的脂质探针将EV和蛋白质进行分离，然后利用链霉亲和素磁珠将EV捕获，接下来利用特异性的抗体管核苷酸探针对EV的靶蛋白进行识别并标记，再寡核苷酸探针上存在引物交换反应扩增标签核酸（PER）的引物，在匹配的发夹和酶存在下可以形成具有重复单元的长单链。该长单链是Cas12a系统的靶序列，与其结合后，Cas12a蛋白被激活以非特异性的切割周围的ssDNA报告基因，释放被淬灭的荧光基团，实现信号输出，通过荧光检测可以对靶标EV蛋白进行定量。图1 原理图 首先，利用超速离心机对MDA-MB-231的EV进行分离，用于标准对照，TEM显示EV呈杯状。NTA检测显示分离的EV大小在30至200 nm之间，对每μL1.5×1010浓度的EV进行蛋白质印迹验证EV和亲本细胞蛋白质表达，验证的蛋白包括钙连接蛋白、TSG101、CD63、CD9和CD81。随后利用获得的EV对MESS的过程进行了表征和优化，研究使用FICT标记磁珠和Dil标记EV与Dil标记的无EV样品进行对照，验证了EV通过MESS捕获到磁珠表面。在不同浓度的脂质探针回收率验证中发现1μM时的回收率最高。此外通过蛋白质印迹测定EV特异性蛋白的方法对MESS和超速离心分离EV的效率进行了比较，发现MESS的捕获效率维49.6%，超速离心的捕获效率为41.2%。进一步的研究还通过对血浆进行EV加标验证了其在实际应用中的检测效果，研究发现复杂样品在某种程度上对MESS的EV捕获产生了干扰，但是这种干扰可以通过脂质探针浓度的增加减小。此外，研究还将本方法的EV分离与其他方法进行了比较（表1）。 图2 MESS性能与超速离心方法进行比较
使用MESS分离EV后，本研究使用三个步骤进行了EV蛋白的检测（图3），包括抗体寡核苷酸探针捕获结合EV表面的CD81蛋白，PER反应触发和通过Cas12a系统实现的信号输出。进一步的研究还对比了该方法和其他检测方法（表2）。图3 MESS2CAN用于EV检测 表2 MESS2CAN与其他检测方法的比较 为了在实际应用中进行MESS2CAN的可行性检测，将其应用于四种乳腺癌细胞系的EV蛋白质分析（图4）。分析显示其在检测EV蛋白表达水平方面与荧光成像一样有效，且对于靶蛋白表达低的 EV，MESS2CAN显示的靶蛋白表达水平比荧光成像增加了 10% 以上，这表明MESS2CAN对于检测低表达蛋白特别有利。图4 MESS2CAN对四种来自乳腺癌细胞系的EV进行蛋白质分析进一步地，展示了MESS2CAN在乳腺癌诊断中用于EV蛋白分析的实际应用（图5）。研究首先验证了MESS2CAN对加标血浆样本中肿瘤标志物阳性（HER2、EGFR 和 EpCAM 阳性）EV 的敏感性，然后，从人类受试者中收集了 90 个临床试验样本，其中 30 个来自 HER2 阳性乳腺癌患者 （HER2 BC），30 个来自三阴性乳腺癌患者 （TNBC），30 个来自健康供体 （HD）。EV上的EpCAM在区分两个BC组和HD组方面显示出了优异的诊断性能。研究结果表明了EV上的HER2、EpCAM和EGFR可能是乳腺癌诊断中实用地蛋白质生物标志物。这也证明了MESS2CAN在为体外诊断提供灵敏和特异性 EV 蛋白分析方面的潜力。 
图5 通过 MESS2CAN 进行 EV 蛋白分析，区分来自 HER2 BC、TNBC 和 HD 的临床样本点评： 1、利用脂质探针膜特异性的快速分离了EV，相比与传统的EV分离方法速度更快。 2、抗体寡核苷酸探针完成信号转化，PER实现了信号放大并利用Cas12系统完成了信号输出。
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