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浅谈数字PCR 简介 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，近年来，分子生物学技术发展迅速，尤其是基于PCR衍生出的一系列技术，因其具有操作简单、快速准确、特异性强且灵敏度高的特点，己被广泛应用于各种检测领域。1983年，美国Mullis教授发明了PCR技术用于核酸检测，其被称为第一代PCR技术，随后PCR技术出现井喷式发展。1992年科学家们在PCR技术的基础上引入荧光化学物质（探针/染料），发明了定量PCR技术(quantitative PCR, qPCR)。而数字PCR (digital PCR, dPCR)是20世纪90年代末发展起来的一种核酸分子绝对定量技术，被称为第三代PCR技术。  PCR技术的发展 技术原理 “digital PCR”一词首次于1999年在Kinzler和Vogelstein发表的论文中被使用，他们描述了通过分割样品以在384孔微孔板中进行一系列PCR来定量样品中的KRAS基因突变。数字PCR的核心是通过有限稀释和泊松分布统计对大规模的单分子扩增实现拷贝数的直接绝对定量：PCR扩增结束后有荧光信号单元记为1,无荧光信号则记为0，即根据荧光信号的有和无将反应单元分别定义为阳性和阴性，再对反应单元总数和阳性反应单元数目进行统计，根据泊松分布公式即可计算出DNA模板分子的起始浓度。相比于前两代PCR技术，dPCR能够实现DNA模板的绝对定量直接获知目标核酸分子的个数，提高了检测灵敏度和准确度。  数字PCR技术原理 dPCR分区方法 数字PCR的检测要点在于将PCR反应液分区至数万个微反应单元，从而实现单分子扩增。目前数字PCR分区方法主要包括2种：基于油包水微滴生成技术的液滴式数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)和微阵列芯片式数字PCR(chip digital PCR，cdPCR)。 ddPCR主要是设计带有微流道通道和反应腔室的芯片，在反应腔室内通过油水两相间隔得到成千上万个微小液滴，PCR扩增后通过统计液滴的荧光信号计算目标基因的拷贝数。这种特殊的微滴在进行PCR时能够保证完整的形态，不会互相扩散，也阻止PCR混合物液滴在热扩增过程的蒸发。  微滴式数字PCR cdPCR是主要通过芯片设计，在芯片上蚀刻有上万个相同体积的微孔方阵，将纳升液体封闭在高通量的微池或微量通道中进行后续的PCR扩增及扩增后结果直接判读。  微阵列芯片式数字PCR 国内外数字PCR平台 目前，国内外很多公司都拥有自己的产品，国际方面，近年来，Bio-Rad、赛默飞等巨头公司纷纷通过收购、投资等方式布局数字PCR业务，目前上市的有例如：BioRad-QX200AutoDG、Thermo Fisher -Quant Studio 3D Digital PCR System、Qiagen-QIAcuity等。国内方面，尽管我国数字PCR行业起步较晚，大多公司尚处于早期融资阶段，但在国家鼓励医疗器械创新的大背景下，数字PCR成为了近年广受关注的热点领域之一，国产数字PCR平台有：领航D3200液滴数字PCR系统、永诺MicroDrop-20微滴式数字PCR系统、臻准AccuONE 数字PCR系统、新羿TD-1数字PCR等。 dPCR的优势 （1）绝对定量 常规PCR和实时荧光PCR定量检测都需要已知拷贝数的标准DNA制定标准曲线，由于样品测定在各种条件上不会完全一致，会造成PCR扩增效率的差异，从而影响定量结果的准确性。而dPCR不受标准曲线和扩增动力学影响，可以进行绝对定量。 （2）样品需求量低 在检测珍贵样品和样品核酸存在降解时具有明显的优势。 （3）高灵敏度 dPCR本质上是将一个传统的PCR反应分成了数万个独立的PCR反应，在这些反应中可以精确地检测到很小的目的片段的差异、单拷贝甚至是低浓度混杂样品，且能避免非同源异质双链的形成。 dPCR的应用 （1）基因突变检测 对于各种基础研究和临床应用来说，罕见突变的鉴定非常重要。证明临床样本中是否存在突变的可靠技术为癌症检测带来了巨大希望，因为突变代表了肿瘤疾病的分子遗传标志。目前基因突变的检测方法主要是PCR或Sanger测序法，但这两种方法对低含量的基因突变检测灵敏度低，且难以满足早期突变筛查的需要。dPCR被首次提出也正是应用于基因突变的检测，结果显示dPCR对基因突变的分析灵敏度高，且可以对复杂组织进行检测。 （2）致病菌检测 致病菌是导致食源性疾病发生的主要原因。通过设计致病菌的靶基因序列的特异性引物和进行扩增是应用PCR技术实现检测的主要原理。dPCR作为第三代PCR技术，提高了检测的灵敏度和准确性，减少了前期的增菌培养过程，大大缩短了检测分析的时间，而且不需要建立标准曲线即可实现对目标分子的绝对定量检测。 （3）下一代测序方面 dPCR平台可以与NGS对接，实现对测序文库的质量控制、提供对测序文库的定量分析和质量评估信息。一方面，dPCR对NGS的测序结果进行验证，对诸如单核苷酸多态性，突变及拷贝数变异在内的基因组变异进行验证，确保测序结果的可信度；另一方面，所得到的结果还包含反映测序文库质量的信息，如接头与接头二聚体、错误连接片段、过长连接片段等，这是当前其他方法所不具备的优势。 此外dPCR技术还可用于鉴定罕见的等位基因发育异质肿瘤、测量基因拷贝数变异分析和甲基化位点分析、产前诊断、游离DNA/RNA检测、血流感染等领域。dPCR 的优势体现在许多方面，dPCR更准确、更灵敏。更重要的是，它在快速、轻松的诊断方面给患者带来了巨大的好处：一方面，对于一些过去难以准确诊断的疾病，例如肺外结核，使其采样可能更容易，因为现在可以通过dPCR对复杂且模板含量低的样品进行准确的诊断分析；另一方面，基于PCR的技术比血清学或病原体培养测试提供更快的读数，而dPCR克服了qPCR的准确性问题，这使其更适合临床使用。  使用数字PCR对临床样本进行分析的示例 总结 数字PCR通过从最低限度稀释的样品中扩增单个DNA模板，将传统PCR获得的指数模拟信号转换为线性数字信号，从而可以对PCR产物进行统计分析。与qPCR相比，它提供绝对定量，并且对于低丰度 DNA更加灵敏和特异。但是，试剂成本和dPCR仪器价格仍然居高不下，这使得它很难在条件一般的医院或实验室中推广。未来，当dPCR技术最终达到可承受的价格时，应当会有更多的dPCR应用在医院和实验室进行，可以产生更加灵敏、准确、可靠的实验数据或临床诊断结果。 参考文献 [1]Morley, A.A., 2014. Digital PCR: a brief history. Biomol. Detect. Quantif. 1 (1), 1–2. [2]Gezer, U.; Bronkhorst, A.J.; Holdenrieder, S. The Clinical Utility of Droplet Digital PCR for Profiling Circulating Tumor DNA in Breast Cancer Patients. Diagnostics 2022, 12, 3042. [3]Vogelstein B, Kinzler KW, Digital PCR. Proc Natl Acad Sci U S A 1999;96:9236–41. [4]Gudrun Pohl & Ie-Ming Shih (2004) Principle and applications of digital PCR, Expert Review of Molecular Diagnostics, 4:1, 41-47, [5]Jim F H, Simon C , Carole A F. Clin. Chem. , 2015, 61( 1) : 79. [6]Barrett AN,McDonnell TC, Chan KC, Chitty LS. Digital PCR analysis of maternal plasma fornoninvasive detection of sickle cell anemia. Clin Chem. 2012 Jun;58(6):1026-32. [7]Yang, J., Han, X., Liu, A., Bai, X., Xu, C., Bao, F. et al. (2017) Use of digital droplet PCR to detect mycobacterium tuberculosis dna in whole blood-derived dna samples from patients with pulmonary and extrapulmonary tuberculosis. Front. Cell. Infect Microbiol. 7, 369 [8]Haiyi Li, Ruolan Bai, Zhenyu Zhao, Lvyan Tao, Mingbiao Ma, Zhenhua Ji, Miaomiao Jian, Zhe Ding, Xiting Dai, Fukai Bao, Aihua Liu; Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Biosci Rep 21 December 2018; 38 (6): BSR20181170. 作者：伍威 蒋萍 |
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