表 1. 常见的用于蛋白偶联反应基团。 反应很多,本篇只讲 NH2 和 SH 反应 ,在文章末尾小 M 会告诉大家基本的原理!在这里我们先来到大家最关注的环节:如何标记蛋白?以及使用过程中有哪些注意事项? 染料标记蛋白,主要包含以下步骤: 蛋白标记时蛋白溶液的配制,以下几点十分重要!
注意事项:蛋白必须在不含伯胺和铵离子的缓冲液中,这些基团会和蛋白争夺结合位点,会影响标记效率。 蛋白溶液配好了,我们现在开始配染料溶液,使用无水 DMSO 配制染料溶液 (多为 10 mM ),染料在 DMSO 稳定性较好,剩余染料溶液可在 - 20℃ 分装保存 1 个月。如果是水溶解,染料有易被水解的性质,建议现配现用。 我们在标记时,首要注意的是染料和蛋白的配比问题,染料过少,反应不完全,标记量太少,染料过多,则不易纯化。通常,我们推荐染料与蛋白的摩尔比在 5:1-20:1。 案例: 此处我们以 CY3 为例,假如所需标记蛋白为 500 μL 2 mg/mL 的 IgG (MW=150,000),用 100 µL DMSO 溶解一管 1 mg CY3 染料,则所需 CY3 体积为 3.95 μL,详细计算流程如下: 1)mmol(IgG)=mg/mL(IgG)×mL(IgG)/MW(IgG): 2 mg/mL×0.5 mL/ 150,000 mg/mmol= 6.7×10-6 mmol 2)mmol(CY3)=mmol(IgG)×10: 6.7×10-6 mmol×10=6.7×10-5 mmol 3)µL(CY3)=mmol(CY3)×MW(CY3)/mg/µL(CY3): 6.7×10-5 mmol× 590.15 mg/mmol/0.01 mg/µL =3.95 µL
荧光标记结束后,我们需要纯化蛋白去掉多余未结合染料防止其对实验的干扰,常用的纯化工具为亲和层析柱和透析袋。 表 2. 层析柱和透析袋的对比。 忙忙碌碌终于大功告成,那么如何检测我们是否标记成功呢,通常是以下几种:
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伯胺 (-NH2) 存在于每条多肽链的 N-末端 (称为 α-氨基) 以及赖氨酸残基的侧链中(称为 ε-氨基)。由于伯胺在生理条件下带正电荷,因此它通常朝外,使得其更易于偶联而不会使蛋白质结构改变。从我们的表中可以看出,许多反应基团均可以和伯胺基结合,而在荧光标记中,最常用的是还是 NHS 活化酯 (SE)[1]。 图 1. NHS 酯图示。 NHS 活化酯 (SE) 图 2. NHS 反应图示。 (R)表示具有 NHS 反应基团的标记试剂或交联剂的一端; (P) 表示含有靶标功能基团 (即氨基,–NH) 的蛋白质或其他分子。
巯基 (-SH) 存在于半胱氨酸的侧链中。在进行交联反应时,必须将其还原成巯基,使其可以与大多数类型的反应基团进行交联。巯基对马来酰亚胺、卤代乙酰基和吡啶二巯基具有反应活性,在蛋白巯基标记中,马来酰亚胺的荧光探针最为常见[3]。 图 3. 马来酰亚胺图示。 马来酰亚胺(Maleimides) 图 4. 马来酰亚胺化学偶联到巯基的反应图式。 (R) 表示具有马来酰亚胺反 应基团的标记试剂或交联剂的一端; (P) 表示含有靶标功能基团 (即巯基,– SH) 的蛋白质或其他分子。
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