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基于透明化包埋技术的 外周神经连接图谱成像  本期青科沙龙关键词 TESOS技术 透明化包埋 投射重建 fMOST技术  生物医学成像正在由二维走向三维。获取完整的生物组织介观尺度三维结构信息是生命科学基础研究的重要目标。然而，组织的不透明性极大地阻碍了光学成像的深度。为什么生物物质看起来是不透明的呢？首要原因是光的散射。生物组织中含有水、脂肪、蛋白质、矿物质等多种成分，其不均匀分布会导致光发生强烈的散射，使光无法直接穿过组织。另一方面，机体内的血红蛋白、黑色素等物质可吸收光，限制光线通过。为了解决上述两个问题，组织透明化技术由此诞生。一方面，通过脱色技术减少光的吸收，另一方面，利用含有高折射率介质的透明液取代样本中水分和脂质，平衡组织折射率，减少光的散射，从而使组织实现光学透明。 一个常见生活现象可以很好地帮助我们理解组织透明化技术的原理。当我们把一整块透明的冰砸碎后，冰渣是不透明的白色。因为里面的水、冰、空气三种组分折射率差异巨大。接着我们把碎冰放入水中，冰渣会立刻变回透明。组织透明化技术的过程其实与此过程原理完全一致。
2024年1月3日，北京脑科学与类脑研究所赵瑚教授团队于Cell Research发表封面文章Mapping of individual sensory nerve axons from digits to spinal cord with the transparent embedding solvent system，报道了这一新技术及其应用。 1 研究过程  接着，研究团队设计了一套放置样本的Magmount装置。该装置用于将透明化包埋样本放置于显微镜载物台，同时实现样本的灵活转移和精确复位。有了透明化包埋样本 Magmount装置 石蜡切片机，TESOS技术可以与市面上几乎所有商用正置共聚焦/双光子/光片显微镜体系（Leica, Nikon, Olympus, Zeiss, 3i等等）结合，实现任意组织类型大样本高分辨成像。无需单独开发专用成像系统，也无需对显微镜本身做改动。这种高度的灵活性是TESOS技术的一个巨大优势。与传统切片成像体系比如fMOST，ViSoR 或者Mouselight相比，TESOS大大降低了神经连接图谱成像这一高大上技术的实现成本。 透明化包埋后的样本拍摄过程简单明了。样本粘结于Magmount装置，一起固定于载物台上，用选定镜头像拍切片一样对样本表面三维图像块进行深度成像。拍摄深度取决于镜头工作距离以及对分辨率的需求。拍完表浅区块后，将样本转移至石蜡切片机切削掉成像过的区域（或使用电机磨削），然后再转移回显微镜拍摄下一个三维图像块。最后基于图像块之间的重叠区域拼接为完整的大三维图像块。比如说，我们可以使用最常用于拍摄切片的高分辨率40×/1.3NA 油镜 （工作距离240微米）拍摄样本表面大概350微米厚度的样本（TESOS样本无需盖玻片，从而可以拓展170微米的工作距离），然后切片机切削去约300微米厚度，接着拍摄下一个350微米厚度组织块。最后通过约50微米的重叠区将上下两个图像块拼接成为一个650微米厚度连续图像块。重复上述操作，就可使用高分辨率短工作距离镜头拍摄任意大小样本。小型的图像数据拼接（小于100GB）可以用Image J实现。团队自己也编写了TESOS-Stitcher软件用于更大规模图像数据的拼接。   TESOS透明化包埋后利用光片显微镜进行成年小鼠全身神经成像 （双通道拍摄，样本总体积100×35×20mm3，总拍摄时长120小时，原始数据量约70TB） 与光片显微镜相比，共聚焦显微镜具有更高的成像分辨率、更好的成像效果，高倍镜下能够获得更多的生物学细节。团队进一步利用TESOS透明化包埋结合徕卡共聚焦显微镜20×/0.95NA镜头成像，对新生小鼠全身的神经分布进行了亚微米级分辨率的重建。 大样本的高质量高分辨率成像是神经投射研究的重要挑战之一。团队充分发挥TESOS透明化包埋的技术优势，利用共聚焦显微镜40×/1.3NA镜头，先后完成了小鼠大脑皮层一个1.5毫米厚度脑组织块的亚微米级分辨率成像、包含肌肉和椎骨的小鼠背根神经节及相应的脊髓内感觉神经亚微米级分辨率成像（、以小鼠前爪为代表的单轴突分辨率外周神经组织成像，并通过病毒标记的手段完成了支配小鼠前爪肉垫的其中12个感觉神经元在脊髓内投射的重建及分析。 最后的终极技术挑战是感觉神经元的全貌重建。一个感觉神经元其外周末梢可以远在指尖，连接的传入神经纤维穿行于各类复杂软硬组织，将承载着感觉信号的电刺激传递到位于脊髓背根神经节的胞体，然后再通过中枢分支投射到脊髓内部。正是由于这样复杂而长的组织结构，哺乳动物的单个感觉神经的全貌从来没有被完整重建。 团队利用成体Thy1-EGFP小鼠，进行了皮肤上的感觉神经末梢到背根神经节再到脊髓的跟踪拍摄，绘制了5个神经元的完整投射行程，实现了单个神经元从外周到中枢投射重建的技术突破。 2 研究结论 TESOS是对传统组织透明化及三维成像技术的一种理念革新。其核心概念在于“透明”和“包埋”。“透明”是TESOS与基于超薄切片的大尺度三维成像技术（以fMOST为代表）的最大区别。聚合后的良好透明度保证了成像质量，也使得TESOS技术与包含光片显微镜、共聚焦显微镜等多种成像系统的有机结合成为可能。TESOS包埋形成的有机树脂与其他水性透明化技术中的琼脂糖包埋凝胶截然不同，其良好的机械硬度及切割性能大大提高了操作的稳定性，切削（磨削）后样品变形小，数据拼接及重建具有良好的准确性。这一特性使得TESOS相较于ViSoR2（目前多用于大脑样品处理）有更广泛的适用范围，能够同时适用于中枢及外周的处理与成像。 原文链接 Mapping of individual sensory nerve axons from digits to spinal cord with the transparent embedding solvent system | Cell Research (nature.com) 直  四川大学华西口腔医学院伊亚婷博士、张士文博士、门乙博士、北京脑科学与类脑研究所博士生研究生李有淇为论文的共同第一作者，北京脑科学与类脑研究所赵瑚教授、戈鹉平教授、曲靖医科大学何永文教授为论文的共同通讯作者。 神经成像的相关研究一直是科研的热门方向，在调研了一线科研工作者的需求后，我们联系并邀请到了本文通讯作者：北京脑科学与类脑研究中心高级研究员——赵瑚对本项研究进行分享。 1 讲者信息 北京脑科学与类脑研究中心高级研究员——赵瑚 2 主办平台 华安生物、深究科学、生物世界 3 直播时间 2024年3月12日 20:00-21:00 |
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