氢水治疗轻度脑损伤机制研究【天坛医院】

研究亮点

本研究使用“可断裂平台”作为脑外伤建模方法，避免发生颅骨粉碎，并模仿现实世界患者中的剪切力损伤。

研究提供rmTBI后病理变化的多个时间特征（伤后1/3/7/14/30天）。

通过使用西方印迹、免疫荧光、MRI/MRS扫描和行为测试，我们全面探索了rmTBI对病理学、生理学和行为的影响。

本研究初步阐明了将富含氢的水作为膳食补充剂用于缓解rmTBI后期症状的治疗潜力。

摘要

背景：重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）可能导致躯体、情感和认知症状，在最初受伤后持续多年。尽管已经探索了各种治疗方法以促进rmTBI后的恢复，但在rmTBI后早期干预的最佳时间窗口尚不清楚。先前的研究表明，富含氢的水（富氢水HRW）可以穿透血脑屏障，减轻局部氧化应激，并在严重创伤性脑损伤患者中减少神经元凋亡。然而，关于富氢水对rmTBI影响的研究很少。

目的：这项研究的目的是探索rmTBI和富氢水治疗后的以下变化：（i）通过免疫印迹技术观察炎症小体激活和与氧化应激相关蛋白表达的时间变化，（ii）通过磁共振波谱观察体内神经元/髓鞘相关代谢物浓度的时间变化，（iii）通过免疫荧光观察晚期rmTBI的髓鞘结构变化，以及（iv）伤后焦虑/抑郁样行为和空间学习记忆障碍。

结果：在rmTBI组中，NLRP-3表达在7和14 DPI时升高，炎症小体标记水平在30 DPI时恢复正常。氧化应激在伤后的第一个月持续存在。富氢水替代显著降低了前额皮质和海马CA2区Nrf2表达，分别在14和30 DPI时。在MR-ADC图像上观察到海马水肿和局部胶质增生以及丘脑的限制性扩散。在rmTBI组中，tCho/tCr比率升高，而tNAA/tCr比率在30 DPI时降低。与其他组的小鼠相比，rmTBI组的小鼠在高架十字迷宫中花更多时间探索开放臂（P < 0.05），并且在迷宫中更活跃（行走的总距离更长）。在糖水偏好测试中，rmTBI组表现出快感缺失。在莫里斯水迷宫测试中，rmTBI组找到隐藏平台的潜伏期比假手术组和富氢水组长（P < 0.05）。

结论：早期使用富氢水干预可以减轻炎症小体的组装并减少rmTBI后的氧化应激。这些变化可能恢复局部少突胶质细胞功能，促进髓鞘修复，预防轴突损伤和神经元凋亡，并缓解抑郁样行为和认知障碍。

1. 前言

轻度创伤性脑损伤（mTBI）占所有创伤性脑损伤（TBI）病例的80%以上；在特定人群，例如运动员和老年人中，mTBI可能会发生不止一次，从而导致重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）的诊断。rmTBI与一系列症状有关，包括持续性头痛、记忆力下降、学习困难、执行功能障碍、人格改变和认知能力受损。一些患者表现出与脑震荡后综合症（PCS）相似的症状，病程较长，最严重的患者会进展到不可逆的痴呆，并在死后被诊断出慢性创伤性脑病（CTE）[1]。无论症状严重程度如何，患者可能会与社会隔离，无法工作。

TBI的病理生理机制已被广泛研究，氧化应激损伤在TBI发病机制中的作用已得到公认。研究人员提出，颅脑冲击可能会导致微血管的短暂收缩，伴随内皮细胞损伤，灌注减少，以及细胞内ATP含量耗竭，导致线粒体膜不稳定，进而产生活性氧（ROS）。细胞稳态的破坏导致自发性凋亡和焦亡，细胞内容物的释放进一步导致局部炎症因子水平升高[2]。炎症反应导致血脑屏障破裂，局部炎症相关细胞因子（IL-1、TNF-α和Iba-1）水平增加，导致胶质细胞异常增殖[3]。可以观察到脱髓鞘变化，持续的炎症反应可能影响轴突髓鞘的修复。受伤区域神经回路的功能失调导致动物模型行为异常[4]。

尽管典型TBI的发病机制已被阐述，但具体机制仍存在争议。近年来，研究人员建立了几种rmTBI动物模型，旨在重现临床患者观察到的行为表现[5]，[6]。在这项研究中，我们使用了一种新的模型，通过对清醒小鼠进行连续7天的冲击伤害来建立。该模型显示出焦虑样行为的稳定增加，伴随着空间学习和记忆能力的损害，以及探索行为和求奖励行为的减少[7]。

在人类中，皮层下区域负责情绪和记忆。在这项研究中，我们关注海马区，它负责编码记忆，并与记忆巩固和决策有关。海马区的缺血可引起认知功能障碍，它也是阿尔茨海默病患者受影响的主要区域，其特征是谷氨酸神经元的减少[7]，[8]。根据Blum等人的研究，空间学习和记忆形成与大鼠海马CA1/CA2神经元中丝裂原激活蛋白激酶的磷酸化有关[9]。然而，其他大脑区域对海马的正常功能是必需的，研究人员揭示了海马与前额皮质（PFC），尤其是腹侧内侧前额皮质（vmPFC）之间的联系，后者接收来自海马（CA1/CA2）的输入，并向伏隔核（ACB）、中缝背核（DRN）和外侧缰核（LHb）发送纤维[10]。我们假设vmPFC功能及其投射的损害可能导致上述行为变化和认知障碍[11]，[12]，[13]。

确定rmTBI的症状是由神经元还是它们的投射纤维引起的存在重大障碍。在临床实践和动物实验中，大多数rmTBI患者和动物模型没有局灶性神经学体征，症状可能在受伤后数年或数月才出现[14], [15]。此外，先前的研究揭示了在rmTBI大鼠的大脑胼胝体中，在受伤后60天出现了显著的轴突/髓鞘破坏。这些发现表明，神经丝的功能障碍可能负责rmTBI的延迟症状，而不是神经元的直接损失[16], [17]。

我们相信早期干预可以减轻海马体和mPFC中的炎症小体激活，促进髓鞘修复并改善预后。氢分子是抗氧化剂，可以轻松制备和保存，水是氢参与氧化还原反应后形成的唯一产物。在我们小组之前的研究中，我们发现氢盐水（HS）处理可以有效降低sTBI模型中大脑丙二醛（MDA）水平和NLRP-3炎症小体的形成。HS还可以抑制神经元谷氨酸介导的钙内流，减轻细胞钙过载引起的损伤，显著降低炎症细胞因子TNF-α和IL-1β的水平，并在重要脑区拯救神经元[18], [19]。rmTBI后的二次损伤和修复可能与sTBI后具有相似的机制；然而，关于氢气治疗对rmTBI预后影响的研究很少。研究人员报告说，氢气疗法能够减少羟基自由基的水平，同时对正常生理过程所需的细胞内ROS水平如H2O2、NO2·和O·的影响较弱，表现出良好的选择性，在脑血管缺血再灌注损伤模型中[2], [20]。在本研究中，我们使用富氢水（富氢水）代替HS。富氢水和HS之间的区别在于氢的浓度。在大气压下，水中溶解的氢气的最大浓度仅为1.6 ppm（百万分之一）。然而，储存在铝罐中的富氢水中的氢气浓度可以达到10 ppm。因此，每天摄入相同量的水，富氢水可以将更多的氢分子输送到血液中，增加氢浓度。

在本研究中，我们研究了早期富氢水治疗对rmTBI小鼠局部损伤和修复的影响，以及相应的行为变化，我们的结果表明富氢水有潜力治疗rmTBI。

点评：简单说就是，反复撞头会发生一种脑损伤，这种疾病的研究已经比较充分，但治疗方面存在无药可用的情况，过去该团队研究过氢气盐水治疗急性脑损伤，根据炎症和氧化损伤的病理生理学基础，推测氢气对这种慢性脑外伤也有效果，于是本研究选择了更高浓度氢水研究了这种疾病。研究结果证明，氢水对这种反复撞头引起的慢性脑损伤具有治疗效果，当然要尽早使用才好。这一研究可能给某些需要撞头的职业运动员，以及不小心意外撞头的患者，提供了一种新的潜在治疗方法。

论文作者主要来自首都医科大学北京天坛医院神经外科

Lu, Shenghua, et al. "Decoupling the mutual promotion of inflammation and oxidative stress mitigates cognitive decline and depression-like behavior in rmTBI mice by promoting myelin renewal and neuronal survival." Biomedicine & Pharmacotherapy 173 (2024): 116419.

以下是具体的研究方案及数据结果：

2. 研究方法

2.1. 动物和分组

共获取了120只C57BL/6小鼠（雄性：雌性 = 1:1，年龄10-12周，体重：20.43±0.95 g），来源于北京维通利华实验动物技术有限公司。样本量基于先前的研究结果计算，并增加了20%以补偿实验过程中的损失[18], [19]。使用随机数字表将动物随机分配到假手术组（n = 24）、rmTBI组（n = 48）或富氢水组（n = 48），研究人员不了解分组信息。小鼠按每笼4只饲养，光周期为12小时光照/12小时黑暗，提供无菌食物和水（分组前所有动物均饮用纯净水）。富氢水（富氢水，氢气浓度3 ppm）由北京活力氢科技有限公司（中国北京）提供。富氢水组的动物从受伤第一天起至最后一次伤害后30天（DPI 30）每天使用带刻度的瓶子和防滴吸管提供150 ml 富氢水（每笼n = 4），水瓶每隔12小时手动补充一次，以确保有足够的富氢水，平均消耗量为（2.1±0.2 ml/12h）。

2.2. rmTBI建模和动物排除

小鼠被麻醉4%异氟醚60秒以保持静止，同时清醒，使用麻醉机（R5805, RWD Life Science Co., 深圳， 中国）精确控制剂量。假手术组的动物接受相同的麻醉程序但不受伤害，以控制重复麻醉的效果。使用rmTBI模型装置诱导重物坠落伤害（图1)[21]。小鼠放置于单层铝箔上，并手动定位在导向管下（图2）。通过从100厘米高度经塑料管向 bregma 投下一个90克重物（主体为不锈钢制成，接触面直径为ABS塑料帽）来诱导rmTBI（连续7天每天重复1次）（图3）。轻微创伤性脑损伤评分（mTBIS）和神经学严重程度评分（NSS）用于评估每次受击后反射的短暂丧失，mTBIS > 3或NSS > 2的动物由于可能存在颅内出血和结构损伤而被排除出实验[22]。如果在MRI检查和脑组织采集过程中发现颅内血肿和局部脑挫伤，该动物及其之前的行为结果也将被排除（rmTBI组排除了7个对象，富氢水组排除了9个对象，因为它们在受击后出现颅内血肿或较高的mTBIS和NSS）。

图1. 改良的重物坠落装置，重物的底部连接有一个直径3毫米的ABS塑料帽，该帽对准小鼠的bregma（a），小鼠放置在单层铝箔上。在撞击期间，小鼠穿过铝箔（b）落入海绵盒中，而重物则被限位器（c）保持，避免不受控制的伤害。

图2. (a) 标准的rmTBI小鼠脑标本，黑色方块是冲击中心在脑部的投影，在这个标本中，没有发现结构损伤和出血，符合轻度TBI的定义。(b) 红色箭头指示被排除对象的右侧小脑周围血肿，这种程度的损伤应被归类为中度至重度TBI。

图3. 动物组别分配和实验日程。

2.3. 蛋白质免疫印迹分析

从小鼠大脑中收集位于嗅裂后部（距前囟1.5-3.5 mm）中线（ml: -1~1 mm）处（尺寸2×2 mm）的皮层脑组织。这个样本（PFC）包括大部分腹内侧前额皮层和一小部分背内侧前额皮层。其次，彻底解剖双侧海马体，并获取双侧海马体CA2区域（HpCa2）0.5*1 mm的组织样本。将PFC和HpCA2组织（每个组别n=3）存储在4°C，并使用考马斯亮蓝染色法测量蛋白浓度。将蛋白（30 μg）通过SDS-PAGE分离并转移到聚偏氟乙烯膜上，用5%牛奶封闭2小时，并在4°C下用一抗（抗-NLRP-3，1:2000；抗-FGF-2，1:1500；抗-MDA，1:1200；抗-Nrf-2，1:2000；抗-β-actin，1:500）孵育过夜。膜被洗涤三次，并与二抗（山羊抗兔，1:1000；山羊抗鼠，1:1000）在室温下孵育1小时。使用化学发光法显影印迹，并进行拍照。最后，使用凝胶成像系统（Image Master VDS）进行成像，并使用图像分析软件（ImageJ）进行灰度分析。将每个蛋白带的灰度值与β-actin带的灰度值标准化，计算为相对蛋白表达水平。

2.4. 免疫荧光染色

在30 DPI时收集的标本（n=3/3/3），牺牲后浸泡在4% PFA中48小时，并将脑切片在3%过氧化氢中孵化30分钟，并用正常牛血清封闭30分钟。脑切片被洗涤三次，并在4°C下用抗-α-微管蛋白和抗-MBP抗体孵育过夜。然后，切片用PBD洗涤，并在室温下与Cy3结合的山羊抗兔IgG和Cy3结合的山羊抗鼠IgG孵育2小时。最后，切片用DAPI（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）复染10分钟，并通过荧光显微镜（Leica Biosystems, Wetzlar, Germany）获得整个脑切片的数字图像。

2.5. 磁共振成像

在本研究中，使用动物磁共振扫描仪（Bruker 7.0 T, Germany）进行MRI和MRS，不同组别的动物（n=3/4/4）在五个时间点（1天/3天/7天/14天/30天）进行扫描。所有实验动物在扫描前均经腹腔注射40 mg/kg 2%戊巴比妥进行镇静。每组进行轴向T1/T2/ADC成像；视场为35 mm × 35 mm，层厚为1 mm。使用RadiAnt DICOM viewer（版本4.6.9, Medixant, Poznan, Poland）对图像进行研究，并由放射科医师复查和注释图像。MRS使用化学位移成像进行，采用8×8多体素采集点波谱序列，选择包含海马体和丘脑的切片进行ADC成像。扫描参数保持不变，数据使用LC-Model（v.6.2; Stephen Provencher Inc., Oakville, ON, Canada）进行分析，并采用自定义参数。

2.6.行为学测试

(1) 高架十字迷宫试验

EPM测试广泛用于评估抑郁/焦虑样行为，本研究采用了Komada M等人描述的协议 [23]。EPM装置包括两个相对的开放臂（50 × 10 cm），垂直于两个封闭臂（50 × 10 cm）以及一个中心平台（10 × 10 cm）。摄像机被放置在平台上方1.5 m处进行实时分析。SMART 3.0成像系统（Panlab, Germany）用于记录小鼠在5分钟内的轨迹，以及在开放臂中行进的距离、总行进距离、探索开放臂的时间和探索封闭臂的时间。实验前，动物被放在一个1×1 m的开放区域适应。动物被放置在迷宫的中心区域，头部面向一个开放臂。实验期间，实验者至少距离迷宫2 m远，环境保持安静。

(2) 水迷宫试验

Morris水迷宫（MWM）装置购自Harvard Apparatus, Inc.（水池：直径 = 120 cm，高度 = 30 cm；平台：直径 = 8 cm，高度 = 15 cm）。SMART 3.0系统（Panlab, Germany）用于收集实时数据和图像。实验按照经过充分测试的协议 [24] 进行。三组小鼠在受伤后第30天开始训练。1）适应性训练每天进行4次，持续4天。在此阶段，将小鼠放置在每个象限面对墙壁，并记录小鼠找到平台所需的时间。如果动物在60秒内没有找到平台，则将潜伏期记录为60秒，并且实验者引导小鼠到平台并允许其停留10秒。2）导航阶段在第5天进行。将小鼠放置在平台的对角象限，并记录找到平台所需的时间。3）在探测试验中，移除隐藏的平台，并将之前放置平台的象限视为目标象限。将小鼠放置在与目标象限相对的池中，并记录它们的轨迹30秒。记录在目标象限中花费的时间和行进的距离。若动物静止不动且漂浮超过30秒，则被视为无能力并从实验中排除。

(3) 蔗糖偏好试验

在30 DPI时按照Liu M等人描述的协议 [25] 执行蔗糖偏好测试（SPT）。在SPT之前，每组的小鼠都被给予一瓶饮用水和一瓶1%蔗糖水12小时。之后，所有小鼠单独饲养并禁食12小时。每只小鼠被给予水和1%蔗糖水；测量两个水瓶的重量，并且每12小时更换瓶子的位置。实验持续48小时。通过计算瓶子重量的差异来确定饮用水和蔗糖水的消耗量，并按以下方式计算蔗糖偏好：

2.7.统计学分析

数据使用SPSS（版本20.0, SPSS Inc., Chicago, IL, United States）和Prism 8软件（San Diego, CA, USA）进行分析。使用Shapiro-Wilk测试检验数据的正态性。对于正态分布的数据，使用Student’s t检验和单因素方差分析（ANOVA）比较各组间的平均值。对于偏态数据，使用Mann-Whitney U检验和Kruskal-Wallis H检验进行统计分析。p < 0.05被认为具有统计学意义。

3. 结果

3.1.与rmTBI相关的蛋白质表达的时间变化

3.1.1.富氢水减弱海马和前额皮层(PFC)的炎症

在这项研究中，我们检查了rmTBI后NLRP3的表达。结果显示，与假手术组相比，PFC和海马中NLRP3的表达在7和14 DPI显著增加。经过富氢水治疗后，NLRP3的表达降低（p < 0.05）；在海马CA2区域，7和14 DPI时NLRP3的表达从基线（假手术组，p < 0.05）增加，而rmTBI组和富氢水组之间的差异没有统计学意义（p = 0.20, p = 0.10）（图4，图5）。

图4. 代表性的Western blot图像显示NLRP3、FGF-2、MDA和Nrf2的表达。前额皮层区域NLRP3、FGF-2、MDA和Nrf2水平的定量。用Image J测量相对带密度，并以β-actin进行标准化。*与假手术组相比p<0.05，#与rmTBI组相比p < 0.05。

图5. 代表性的Western blot图像显示NLRP3、FGF-2、MDA和Nrf2的表达。海马CA2区域NLRP3、FGF-2、MDA和Nrf2水平的定量。用Image J测量相对带密度，并以β-actin进行标准化。*与假手术组相比p<0.05，#与rmTBI组相比p < 0.05。

3.1.2.通过测量MDA/Nrf2表达分析氧化应激

丙二醛（MDA）是多不饱和脂肪酸过氧化的最终产物之一，MDA结合蛋白通常被用作氧化应激和抗氧化状态的标记物。在前额皮层和海马CA2区域的MDA结合蛋白水平在rmTBI后增加但未减少。在30 DPI时，rmTBI组的MDA结合蛋白水平显著高于假手术组和富氢水组。除了作为MDA的直接生物标志物外，Nrf2是一种细胞内转录因子，它调节许多编码抗氧化酶、解毒因子和抗凋亡蛋白的基因的表达。它通常被用作对氧化应激反应的标志物。在vmPFC中，14 DPI时rmTBI组的Nrf2表达显著高于假手术组和富氢水组（P < 0.05）。在海马CA2区域，富氢水处理减少了30 DPI时的Nrf2表达（P < 0.05）。氧化应激持续存在于rmTBI后的第一个月。富氢水处理阻止了PFC区域14DPI和HpCA2区域30DPI时Nrf2表达的增加，而在后者区域30DPI时检测到较少的MDA结合蛋白。

3.1.3.FGF-2的组织修复和其他效应

在7 DPI时，各组之间的FGF-2没有显著差异（图4/5）；然而，在14 DPI（PFC）和30 DPI（HpCA2和PFC）时，rmTBI组的FGF-2表达与假手术组相比显著增加（P < 0.05），并且富氢水组在14 DPI（HpCA2）和30 DPI（PFC）时的FGF-2表达与rmTBI组相比减少（P < 0.05）。

3.2.rmTBI后的磁共振成像(MRI)

在T1WI或T2WI上发现有颅骨骨折、硬脑膜撕裂或颅内血肿的小鼠被排除在外。在rmTBI组和富氢水组中，1、3和7 DPI时发现了散在的微出血，并且在14 DPI和30 DPI时这些微出血发展成了病灶和软化灶。在rmTBI组的所有阶段以及富氢水组的早期阶段中发现了海马区T2WI信号增强。在ADC图像上观察到双侧丘脑中的点状低信号不透明区可能是由于神经元肿胀造成的，并且由此产生的细胞内水分子扩散受限可以在ADC图像上检测到。这一特征随着时间的推移逐渐消失（图6）。

图6. 代表性图像显示在DPI 1/3时rmTBI和富氢水组均出现的微出血（白色框）和由撞击引起的结构扰动，在DPI 7/15时也发现了双侧丘脑的限制性扩散和细胞毒性水肿（红色箭头），在rmTBI组海马CA1/CA2区域的水肿和局部胶质增生很明显。

3.3.多次磁共振波谱（MRS）分析rmTBI后

在丘脑中，rmTBI组的tCho/tCr比率在3 DPI达到峰值，并且高于富氢水组（p < 0.01）（图7A）。rmTBI组的tCho/tCr比率随时间持续下降，但在富氢水组保持稳定。然而，rmTBI组的tNAA/tCr比率在第一个月逐渐下降，而富氢水治疗对神经元存活具有保护作用（图7B）。海马区的扫描显示，在30 DPI时富氢水组的tNAA/tCr比率显著高于rmTBI组，表明富氢水治疗后神经元和轴突得到了保护（p < 0.001）（图7D）。

图7. 不同时间点的每种代谢物相对浓度的代表性图片，丘脑区域脂质代谢物(a)和tNAA(b)的相对浓度，海马区域脂质代谢物(c)和tNAA(d)的相对浓度，黑色条代表平均值。（e）MRS分析的兴趣区域对应的T2WI区域。（f）LC-model分析结果的代表性图像，显示了NAA+NAAG/GPC+PCh/Cr+PCr的代谢物峰。**P < 0.01, ***P < 0.001, ns: Mann-Whitney U检验不显著。

3.4.免疫荧光分析髓鞘结构变化

恢复相应区域神经回路的基本条件是髓鞘结构的修复。在这项研究中，我们使用双标免疫荧光染色来评估30 DPI时不同区域的髓鞘形态和密度。在海马区，rmTBI后未检测到神经元核数量的显著差异，但是rmTBI组每单位面积MBP的密度显著低于假手术组（P < 0.05）。富氢水处理后MBP的密度增加，但仍然低于假手术组。在双侧丘脑观察到类似的结果。髓鞘密度降低，簇集和侧支连接的数量减少，结构变得紊乱，交叉联合纤维束变得稀疏。然而，在双侧皮层中，三组之间未观察到MBP密度或神经纤维排列的差异（图8）。

图8. 每个组别（DPI 30）获得的6μm厚冠状脑切片的代表性合并图像，用于2D成像比较（红色：α-微管蛋白，绿色：髓鞘碱性蛋白，蓝色：DAPI）。右下角的比例尺。虚线和框显示放大区域。（a-c）海马，10倍放大；（d-f）海马，40倍放大；（g-i）丘脑，5倍放大；（j-l）丘脑，20倍放大；（m-o）皮层，10倍放大；以及（p-r）皮层，40倍放大。

3.5.高架十字迷宫（EPM）

EPM测试用于衡量啮齿类动物的探索行为在多大程度上克服了它们避光的倾向。在这项研究中，EPM测试被用来评估类似抑郁的行为（本能行为的主导性），并且得到了意料之外的结果。在7 DPI和30 DPI时，rmTBI组的小鼠（62.62，95%置信区间：34.9–94.3）（71.88，95%置信区间：38.77–105）比假手术组（29.25，95%置信区间：14.83–43.67）和富氢水组（12.78，95%置信区间：8.96–16.6）（42.27，95%置信区间：20.49–64.05）的小鼠在开放臂中探索的时间更长（P < 0.05）。rmTBI组的小鼠在迷宫中的活动性（总行走距离）也比富氢水组的小鼠要高，而富氢水组的小鼠行走的距离明显短于假手术组的小鼠（图9b）。

图 9.（一）张开臂探索时间，（b）张开臂距离/总距离之比，（c）EPM总探索距离，（d）rmTBI组和富氢水组的代表性探索轨迹。

3.6. 蔗糖偏好测试

在适应期后，三组小鼠被给予自由饮用含糖水和普通水48小时。每个小组在24小时和48小时时记录两个瓶子的重量，并计算这些时间点的蔗糖对水的摄取比率。在48小时时，rmTBI组的蔗糖偏好度（0.43, 95% CI: 0.39–0.47）显著低于假手术组（0.68, 95% CI: 0.58–0.77）和富氢水组（0.75, 95% CI: 0.66–0.84）（P < 0.05）。假手术组和富氢水组之间没有观察到显著差异（图10）。

图10. 在24小时和48小时称量1%蔗糖水和纯净水的重量。蔗糖偏好度计算为蔗糖水消耗量 / 总水量消耗量。图中数据表示均值 ± 标准误差，***P < 0.001，ns无显著性。

3.7. 莫里斯水迷宫（MWM）

莫里斯水迷宫通常用于通过评估空间学习和形成长期记忆的能力来评价认知障碍的程度，从而识别影响任务表现的因素。三组小鼠的学习曲线在第四周训练日前相似。然而，在这一天，与前一天相比，rmTBI组没有显著进步；而富氢水组和假手术组表现出学习，并且这两组之间存在差异。在导航实验中，rmTBI组的小鼠（40.93, 95% CI: 25.39–56.46）寻找隐藏平台的时间显著长于富氢水组（14.7, 95% CI: 6.68–22.7）和假手术组（10.13, 95% CI: 5.54–14.7）（P < 0.05）（图11C）。在探测试验中，rmTBI组的小鼠（25.4, 95% CI: 19.84–30.95）探索目标象限的时间显著少于富氢水组（57.78, 95% CI: 40.38–75.18）和假手术组（54.88, 95% CI: 45.13–64.63）（P < 0.05）（图11D）。富氢水组和假手术组之间没有观察到显著差异。

图11. 第4训练日莫里斯水迷宫中游泳轨迹的代表性图像。三组在训练日的趋势展示在(a) (b)中，测试日找到隐藏平台的潜伏期和在象限中花费的时间百分比展示在(c) (d)中。不同组寻找隐藏平台的策略展示在(e)中，假手术组的轨迹可视为直线/边缘型（黑色），rmTBI组为随机型（红色），富氢水组为趋势型（蓝色）。

4. 讨论

4.1. 细胞因子风暴在PFC中启动并导致持续的ROS释放

炎症被认为与包括rmTBI在内的许多疾病的发生和发展有关。本研究揭示，在TBI后，NLRP3炎症小体通过两条主要途径被激活。第一条途径中，皮质醇由微胶质细胞分泌，通过CORT受体激活NF-κB途径。第二条途径中，周边细胞肾上腺素、IL-1α、TNF-α和DAMPs/PAMPs也能激活NF-κB途径，增加NLRP3相关蛋白的转录和翻译，最终形成NLRP3炎症小体[26]，[27]。在本研究中，我们发现双侧PFC中的NLRP-3炎症小体激活在伤后早期（DPI7）达到高峰，并在DPI14降至假手术组的水平。海马CA2区域中的NLRP3炎症小体激活在DPI7和DPI14组中也升高，这可能表明rmTBI的发病机制始于直接受影响的PFC区域。这些异常早期出现并在14天内消失，而HpCA2对继发性损伤更敏感，并增加了NLRP-3炎症小体的激活（>14天）。在氧化应激之前，NLRP3炎症小体在伤后早期迅速激活，这个炎症小体在激活后迅速结合含有半胱天冬酶募集域的凋亡相关斑点样蛋白（ASC），进一步激活半胱天冬酶-1途径，导致质膜上形成孔洞并释放IL-1β、IL-18、HMGB1等细胞因子。这个过程启动了局部无菌炎症，小血管内皮细胞对细胞因子风暴做出反应，引发血管痉挛和微血栓形成，导致局部缺血和缺氧。这些快速变化可能解释了在3和7 DPI时ADC图像上观察到的丘脑水分子扩散受限[28]，[29]。

ROS通过氧化磷酸化形成并储存在线粒体中，在那里它们执行正常的生物功能。局部缺血和缺氧导致线粒体ATP耗尽，改变线粒体膜电位，并诱导线粒体ROS的释放。ROS的过度释放导致各种细胞器中的核酸、蛋白质和脂质的过氧化[30]。在本研究中，我们测量了丙二醛（MDA）和核因子红细胞生成素2相关因子2（Nrf-2）两种氧化应激生物标志物的水平。MDA是多不饱和脂肪酸过氧化的最终产物，也是最常用的氧化应激生物标志物。Nrf-2是对自由基敏感的转录因子，负责调节各种抗氧化酶的下游合成[31]。研究人员已经表明，通过抗氧化治疗增加Nrf2途径相关基因的表达也可以抑制NLRP-3炎症小体的激活，减弱下游炎症反应，并减少星形胶质细胞和微胶质细胞的激活，从而发挥抗氧化作用以保护神经元[32]。在多次冲击伤害期间，炎症和氧化应激的相互促进发生，区域性炎症反应增加Ca2+内流，导致线粒体不稳定，随后将氧化的DNA释放到细胞质中，激活下游DAMP途径，组装NLRP-3炎症小体并增加相关蛋白的转录。此外，NF-κβ途径被激活，下游基因激活NADPH氧化酶并产生ROS。在正常情况下，如Nrf-2等调节系统会打破这种相互促进，但重复伤害使这个系统超负荷运转，无节制的炎症和ROS释放最终导致不可逆的皮层下神经元损伤并引起认知障碍[33]，[34]。在我们的研究中，rmTBI组在第一个月末HpCA2区域的MDA浓度相当稳定。然而，PFC（DPI 14）和HpCA2（DPI 30）中的Nrf-2表达在rmTBI组中显著高于富氢水组。与直接氧化应激生物标志物MDA的表达不同，Nrf-2的表达被氧化应激上调，这表明确实发生了氧化应激。这首先在DPI 14的PFC中显现，并持续到DPI 30的海马。富氢水的干预反而下调了Nrf2的表达水平，表明在这个过程中Nrf2的增加可能作为一个无效的氧化应激反应因素，并且可能无法阻止级联反应和保护神经功能。

4.2. 持续的氧化应激上调FGF2表达并延迟髓鞘修复

成纤维细胞生长因子2（FGF-2），在人类和小鼠中普遍表达，参与体外和体内的细胞生长、迁移和成熟。组织损伤后，FGF-2的表达升高，促进组织修复并具有抗炎作用。FGF-2在rmTBI后几天表达上调，并与受伤区域的胶质细胞增生相关，一些研究人员报告称，FGF-2通过FGFR3-Wnt-ERK途径在神经组织中作为抗炎、抗氧化剂和抑制胶质细胞激活迁移的物质[35]。FGF和FGFR对少突胶质细胞系的生长和分化至关重要。在先前的研究中，FGF-2被证明能促进OPC增殖但抑制OPC分化和分泌与髓鞘相关的蛋白。总体而言，FGF-2作为重新髓鞘化的负调节剂[36]，[37]。在本研究中，rmTBI组和富氢水组的FGF-2含量在30 DPI达到峰值，这表明rmTBI后的少突胶质细胞和小胶质细胞增生主要发生在14 DPI之后[4]。FGF-2在rmTBI组中的表达高于富氢水组，这表明富氢水替换可以减少14/30 DPI时皮层和海马中的FGF-2表达。我们认为，FGF-2的表达在伤后14至30天因大脑损伤而升高，这种细胞因子间接干扰了受损髓鞘的修复和少突胶质细胞的正常生理作用，导致胶质细胞增生以及髓鞘结构修复延迟。轴突脱髓鞘影响神经元胞体，导致丘脑及相关神经回路功能障碍。

髓鞘是包裹在神经元轴突周围的一层含水量极低的蛋白质，通常由中枢神经系统中的少突胶质细胞形成；髓鞘干重的70-80%由脂质组成，主要是饱和长链脂肪酸、糖脂和胆固醇[38]。此前认为，一旦生成，髓鞘就会稳定地包裹在神经轴突中，但最近的研究显示，髓鞘的分解和再生在整个生命过程中都会发生，且持续成熟的少突胶质前体细胞（OPCs）会补充髓鞘。如果OPC成熟受到抑制或髓鞘损伤程度超过修复能力，神经冲动的传导速度会减慢，可能导致神经元凋亡，从而影响大脑的基本功能[39]，[40]。在本研究中，rmTBI组的丘脑tCho/tCr比率在伤后早期（3 DPI）显著增加，然后逐渐降至正常水平（14 DPI），这表明髓鞘鞘层的分解被诱导，且局部胶质细胞在rmTBI后几天被激活[41]。

4.3. 皮质下神经元损失的直接和间接途径

在阿尔茨海默病和多发性硬化症等神经退行性疾病中，通常观察到海马区的神经元损失。N-乙酰天冬氨酸（NAA）因其在神经元中的含量稳定而广泛作为神经元生物标志物[42]。NAA是NAA谷氨酸（NAAG）的降解产物，NAAG也是神经元内的关键氨基酸。NAAG参与多种细胞生命过程，如蛋白质合成、脂质生成和分解以及区域渗透压的维持。NAA主要在神经元线粒体中生成，由于NAA和NAAG氢谱吸收峰的相似性，两者在磁共振光谱（MRS）分析中常合并为tNAA [43]。区域tNAA水平的下降通常表明神经元内线粒体功能的紊乱以及含有肌醇（INS）类物质水平的上升，这些物质通常与该区域的活跃胶质细胞发生反应[44]。在之前的脊椎动物研究中，已经显示tNAA水平的升高与神经元密度的增加和神经元轴突的分枝有关，tNAA是整体神经元健康和活动的指标[45]。研究表明，海马区神经元数量减少、树突棘密度和树突分支数量减少与认知功能下降以及神经退行性疾病有关[46]，[47]。在这项研究中，rmTBI组小鼠海马的tNAA/tCr比率在受伤后持续下降，且显著低于假手术组。tNAA/tCr比率在富氢水治疗后短暂下降然后恢复正常水平，在海马和双侧丘脑中观察到类似的下降趋势。以上结果表明rmTBI后双侧海马发生了神经元死亡。

另一种解释是，NAA被包围在轴突周围的少突胶质细胞代谢，尽管tNAA在神经元内的含量相对稳定，但NAA不断被降解、循环和产生；NAA由神经元分泌到细胞外液中，被少突胶质细胞摄取并由酰胺酶II水解，NAA水解产物中的醋酸盐和天冬氨酸重新进入细胞外液，在那里它们被神经元摄取并重新合成[45]。由于少突胶质细胞主要参与NAA的循环，我们推测，在持续的氧化应激下，少突胶质细胞的水解酶无法执行其功能，NAA循环的紊乱和局部积累导致渗透压变化，影响局部微环境，这可能是神经功能缺陷的次要原因[48]。

4.4. 神经回路损伤导致焦虑/抑郁样行为

在啮齿类动物中，焦虑和抑郁样行为经常同时出现，表现为食欲差、体重减轻、活动减少、反应迟钝和脱毛（自我拔毛）。根据目前普遍的观点，中前额皮质（mPFC）和海马的神经营养因子表达异常可能导致神经元萎缩以及伴随前额皮质活动减少的突触可塑性抑制[49]，[50]。由前额皮质调节的下游边缘网络包括杏仁核、背缝核和外侧缰核，其中第一个主要负责焦虑和恐惧，而后两者通常与快感缺失和适应反应有关。这些核团功能受损会导致环境适应能力下降、情绪调节受损以及焦虑抑郁样行为[51]。

重复麻醉和冲击伤使小鼠不断关注潜在威胁，常常导致焦虑样行为，如回避和活动减少。在本研究中，使用高架十字迷宫评估啮齿类动物的焦虑样行为，通过开放臂和闭合臂中所花费时间和行走距离的比率来衡量焦虑样行为的程度[52]。与我们的预期相反，在EPM测试中，富氢水组在7和30 DPI时在开放臂中花费的时间和行走的距离均低于rmTBI组。结果表明，没有富氢水处理的rmTBI组小鼠更喜欢开放区域，并表现出较少的焦虑样行为，这与富氢水干预减少焦虑样行为发生的说法相矛盾。我们推测这是由以下原因造成的。（1）rmTBI可能导致来自PFC的抑制性神经纤维受损，使得下游神经元过度兴奋并导致增加的无组织行为。在这项实验中，我们发现rmTBI组的小鼠不仅在开放臂中花费更多时间，而且在闭合臂中花费的时间和行走的距离也比假手术组和富氢水组多。因此，正常抑制的减少可能会影响EPM测试的结果[53]，[54]。（2）本研究中小鼠所表现出的焦虑样行为可能是对重复外部威胁（冲击伤）的“战斗或逃跑”反应。进行EPM的实验室是发生冲击的同一房间，气味和光线的创伤性记忆可能会导致对抗行为。EPM测试对于检测回避等焦虑/抑郁样行为具有良好的效度；然而，它可能不适用于检测与威胁诱导的对抗相关的行为[55]。

杏仁核、背侧缝核和外侧缰核中的神经回路受损可能导致快感缺失和适应新环境的困难。快感缺失指的是在愉快活动中无法感受到快乐，无法形成奖励反馈循环，这在抑郁症患者中很常见[56]。为了研究rmTBI后的抑郁样行为，我们使用了蔗糖偏好测试（SPT）来评估三组小鼠的寻求奖励行为。SPT基于两瓶选择范式[57]。在24小时和48小时时，rmTBI组小鼠的蔗糖偏好显著低于假手术组和富氢水组小鼠，蔗糖水大约占总消耗水量的一半（46% ± 6%），表明rmTBI组小鼠对饮用水或蔗糖水没有明显的偏好，并表现出明显的快感缺失；然而，在富氢水组和假手术组中，蔗糖水占总消耗水的70%以上（78±10%，70±17%）。在24小时时，富氢水组的蔗糖消耗比例略高于对照组。然而，差异不显著，尽管两个瓶子的位置不断交换，小鼠仍然能够区分两种不同类型的水，并表现出对蔗糖水的偏好，这表明正常的寻求奖励行为。

4.5. 促进髓鞘修复改善空间记忆

海马和旁海马结构对于认知、决策、空间学习和导航很重要，其中腹侧海马与新皮层更密切相关，负责认知、决策以及中长期记忆，而背侧海马主要负责空间和时间感知[58]。

在这项研究中，在训练阶段，三组动物找到目标平台所需的时间逐渐减少，而在平台象限游泳的时间逐渐增加，这表明所有三组动物都具有基本的导航能力和空间记忆。在训练的最初三天里，三组的表现基本相同，到达平台的潜伏期在各组之间没有显著差异。在第4天的训练中，相当于长期记忆形成的时间点，三组动物开始表现出差异，rmTBI组的小鼠与第3天训练相比没有改善，而对照组和富氢水组的小鼠表现出显著的改善[24]。在导航实验中，rmTBI组的潜伏期显著长于富氢水组，在探测试验中，rmTBI组在目标象限停留的时间显著短于富氢水组；然而，富氢水组和假手术组的潜伏期没有显著差异。

先前的研究已经证明，海马中的神经元突触可塑性是空间记忆形成的关键，并且对于导航至关重要[59]，[60]。MWM能够敏感地检测到小鼠空间记忆和导航能力的损害。通过重复训练，小鼠能够根据迷宫外提示形成对平台大致位置的记忆，找到隐藏平台所需的时间反映了小鼠的认知功能和长期记忆。rmTBI组的小鼠在前三天的训练中能够学习，表明它们具有基本的学习能力；然而，在随后的训练日和探测试验中，rmTBI组的小鼠没有学习表现，表明它们的学习能力极限无法通过重复训练克服。rmTBI组的潜伏期显著长于假手术组（P < 0.05），这种受损的学习与海马的脱髓鞘有关。神经信号传导的损害导致的表现类似于神经退行性疾病中观察到的表现。除了结构损伤外，炎症反应导致的局部神经元功能障碍可能会加剧认知衰退[61]。

在重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）后，几种促炎途径被激活，早期使用氢富水（富氢水）治疗可以减少NLRP-3炎症小体的激活和活性氧（ROS）的释放，这两者相互促进。体内磁共振光谱（MRS）结果表明，伤后早期富氢水治疗可以减少脂质滴（围绕神经纤维的髓鞘分解）的数量并防止局部胶质细胞增生，最终增加几个区域中存活神经元的数量。免疫印迹显示rmTBI后持续的氧化应激，成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）及其途径的激活导致局部组织修复，并抑制少突胶质前体细胞（OPC）分化和髓鞘修复。在rmTBI后的小鼠中观察到典型的焦虑和抑郁样行为（例如，自我梳理减少，攻击性行为增加和体重减轻），这是由于边缘系统神经回路受损。令人惊讶的是，给予富氢水的小鼠表现出更多焦虑样行为，这与预期结果相反。我们认为，伤后早期神经兴奋性增加和对威胁的对抗反应可能解释了这一结果。与抑郁症患者类似，rmTBI组的小鼠表现出快感缺失和学习障碍，而髓鞘修复能够恢复寻求奖励的行为，并在rmTBI后期改善空间学习和长期记忆。

5. 结论

目前，rmTBI的演变机制仍在争论中。在高风险群体中进行早期干预以减少小分子产物（例如，富氢水）的研究相对较少，作为一种预防方法。本研究表明，富氢水可以减轻炎症反应对氧化应激的促进作用，将平衡转向髓鞘修复而非重建，拯救轴突和神经元，并改善情绪紊乱和认知衰退。考虑到其易于获取、快速扩散和副作用少，富氢水是rmTBI患者的有前景的治疗方法。

本研究的主要局限性

有几个值得注意的局限性需要考虑。首先，建模方法的选择是初步的。由于其相对较低的稳定性，重物坠落模型已逐渐被TBI研究中的CCI模型取代。然而，它在闭合性创伤性脑损伤模型中仍具有不可替代的价值，特别是由于其固有的不稳定性，可以通过多次重复来补偿。此外，它允许快速部署，无需固定特征，能够在清醒状态下实现冲击并产生剪切力损伤。这种方法确实增加了颅内血肿形成的可能性，并且影响较轻微。在本研究中，通过神经功能评分和MRI识别动物模型；然而，完全避免混淆仍然具有挑战性。先前的实验表明，较重的冲击比轻的冲击更频繁，可能导致本研究整体偏向更严重的伤害（如sTBI）。此外，轻度伤害的累积效应可能导致长期认知障碍和痴呆症状，这可能被原发性脑损伤所掩盖。富氢水的作用机制已被确定为在sTBI患者的早期继发性损伤中进行干预，这可能导致对富氢水对rmTBI症状缓解效果的高估。其次，本研究在样本量设计和过程安排上存在缺陷。基于先前的研究，我们大致计算了样本量，β= 0.2，双侧α= 0.05。然而，在研究过程中，由于纳入了MRS扫描、行为测试和其他非牺牲性测试，计划的样本量无法满足要求。因此，我们对同一实验动物进行了多次测试，例如DPI 7 EPM测试，然后是DPI 30 MWM测试。我们认识到来自行为测试的刺激可能会导致组内差异。此外，MR扫描前的镇静管理变化可能会影响实验动物中几种生物标志物的表达，从而导致分子表现的变化，从而增加组内差异（导致标准差增加）。此外，由于统计能力有限，一些组间差异可能被忽视（例如，DPI 14时HpCA2区域Nrf-2表达的p值为0.075，因此在富氢水干预后显示为非显著差异）。这种程序偏差减少了研究的说服力。

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