大家好,这里是专注表观组学十余年,领跑多组学科研服务的易基因。 肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension, PAH)是一种不可逆的心血管疾病,其特征是肺血管阻力进行性增加,最终导致肺动脉高压和右心衰竭。PAH主要成因包括血管收缩、肺血管重塑和细胞外基质(ECM)沉积。肺血管重塑主要由肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的过度增殖和抗凋亡能力引起。PAH是一种涉及遗传、环境和表观遗传等多种因素的复杂疾病。表观遗传变化在血管重塑中的发病机制已被证实,但关于逆转PAH的特定表观遗传靶点的了解仍然有限。 N6-甲基腺苷(m6A)是一种丰富的内源性化学修饰,对RNA的剪接、翻译、定位和稳定性起着关键作用。m6A的动态和可逆性由甲基转移酶(writers)、去甲基化酶(erasers)和不同的m6A结合蛋白(readers)调控。已有研究表明,m6A调控因子的表达失衡与多种生物过程功能障碍有关,包括凋亡/增殖、发育异常、肿瘤进展、自我更新能力降低和免疫系统异常。尽管有证据表明m6A酶失调参与了PAH发病机制,但m6A调控因子在PAH中的具体作用尚未明确。 2024年2月4日,中南大学湘雅二医院凤一路博士为第一作者、宋洁为通讯作者在《Biomedicines》杂志发表题为“Transcriptome-Wide N6-Methyladenosine Alternations in Pulmonary Arteries of Monocrotaline-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Rats and Novel Therapeutic Targets”的研究论文,文章通过甲基化RNA免疫沉淀测序(MeRIP-seq)和RNA转录组测序(RNA-seq)方法,分析单克隆素(MCT)诱导的PAH大鼠模型和对照组肺动脉组织中的mRNA表达和m6A位点变化,通过GO和KEGG通路富集分析进一步分析差异表达基因的功能。探讨了m6A调控因子表达及其在调控PASMC生物学行为中的作用,以揭示潜在的分子机制。 研究摘要: 本研究利用MeRIP-seq和RNA-seq研究对照组和野百合碱(monocrotaline)诱导的PAH大鼠肺动脉组织中m6A和RNA表达差异。使用GO和KEGG进行功能富集分析,研究了差异表达功能。为了筛选候选m6A相关基因,使用STRING和Metascape数据库构建了蛋白质-蛋白质互作(protein-protein interaction,PPI)网络,并通过对候选相关基因表达进行实时PCR验证。使用免疫组化染色、免疫荧光和Western blot技术进一步研究了m6A调控因子的表达水平,并对大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC)进行增殖实验。研究共鉴定出42个差异表达基因,这些基因的m6A甲基化水平表现出增加或减少(高甲基化或低甲基化)。主要与细胞外基质结构、MAPK和PI3K/AKT通路相关。在PAH组中检测到候选基因着丝粒蛋白F(CENPF)表达增加。研究首次鉴定出一种富含亮氨酸的五肽重复序列(LRPPRC)的m6A reader,该reader在PAH大鼠模型中表达下调。体外实验中,siRNA介导的Lrpprc下调导致大鼠PASMC增殖增强和Cenpf mRNA表达升高。本研究结果揭示了PAH大鼠肺动脉中转录组范围的m6A修饰图谱变化和相关调控机制,可能为未来治疗策略提供新的靶点。深圳市易基因科技为本研究提供MeRIP-seq和RNA-seq技术服务。 研究思路: 研究结果 (1)PAH大鼠模型的m6A基本特征 图1: PAH大鼠模型的m6A基本特征。组织来自肺动脉,每组n=3。
m6A:N6-甲基腺苷;PAH:肺动脉高压;MCT:野百合碱;UTR:非翻译区;CDS:编码序列。 (2)PAH中的差异m6A分析 图2:PAH中的差异m6A分析。
FC:倍数变化;GO:基因本体论;KEGG:京都基因与基因组百科全书。 表1:差异甲基化m6A peaks和相关基因数 (3)m6A修饰基因的转录谱 图3:m6A修饰基因的转录谱。
D-E. GO和KEGG分析分别具有显著变化peak的差异表达基因。 F-G. 两个数据集的DEG分布的火山图。红点代表上调DEG,蓝点代表下调DEG,黑点代表非DEG。 H. 在两个数据集中同时上调的DEG。
表2:数据库中基因的mRNA表达水平(Log2(FC)) (4)PPI网络建立和候选基因鉴定 图4:蛋白质-蛋白质互作(PPI)网络建立和候选基因鉴定。 A–C. 基于上述基因构建的中枢网络。 D. MCT组和对照组(每组n=6)肺组织中Cenpf的相对mRNA表达,数据代表平均值±SEM,并使用Student t检验比较两组组间差异。 E. 血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)刺激(30 ng/mL)下,大鼠PASMC中Cenpf mRNA相对表达水平(每组n=3),以α-Tublin作为内部对照归一化。 F. 人类PASMCs在PDGF-BB刺激下的CENPF mRNA相对表达水平(每组n=3),以GAPDH作为内部对照归一化。 G. 用siRNA转染人PASMC 48h后,经PDGF-BB(30 ng/mL)再处理24h的CENPF mRNA相对表达水平(每组n=3)。 H-I. 以α-Tublin作为内部对照的PCNA蛋白水平的代表性Western blot和定量分析(每组n=3)。 J. 通过IGV观察到Cenpf mRNA转录本上的m6A水平。 PPI:蛋白质-蛋白质互作;SEM:平均值的标准误差;PASMCs:肺动脉平滑肌细胞;PDGF-BB:血小板衍生生长因子BB。 (5)肺动脉高压(PAH)的肺动脉中,leucine-rich pentatricopeptide repeat-containing (LRPPRC) 蛋白表达水平下降 图5: PAH患者的肺动脉LRPPRC表达降低。
表3:m6A调控因子的mRNA表达水平 图6:LRPPRC下调促进肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的增殖和Cenpf表达。
E.计算EdU染色的细胞比率。 F. Cenpf水平的相对mRNA表达(每组n=3)。 关于易基因RNA m6A甲基化测序(MeRIP-seq)技术 易基因MeRIP-seq技术利用m6A特异性抗体富集发生m6A修饰的RNA片段(包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA),结合高通量测序,可以对RNA上的m6A修饰进行定位与定量,总RNA起始量可降低至10μg,最低仅需1μg总RNA。广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症发生与发展、药物应答等研究领域;可应用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测。 大样本量m6A-QTL性状关联分析,传统MeRIP单个样品价格高,通常难以承担。易基因开发建立MeRIP-seq2技术,显著提成IP平行性,实现不同样本间相对定量,降低检测成本。 易基因提供适用于不同科研需求的MeRIP技术:
技术优势:
研究方向: m6A甲基化目前主要运用在分子机制的理论性研究
关于m6A甲基化研究思路 (1)整体把握m6A甲基化图谱特征:m6A peak数量变化、m6A修饰基因数量变化、单个基因m6A peak数量分析、m6A peak在基因元件上的分布、m6A peak的motif分析、m6A peak修饰基因的功能分析 (2)筛选具体差异m6A peak和基因:差异m6A peak鉴定、非时序数据的分析策略、时序数据的分析策略、差异m6A修饰基因的功能分析、差异m6A修饰基因的PPI分析、候选基因的m6A修饰可视化展示 (3)m6A甲基化组学&转录组学关联分析:Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、m6A修饰目标基因的筛选策略 (4)进一步验证或后期试验 易基因提供全面的表观基因组和表观转录组研究解决方案,详询易基因:0755-28317900. 参考文献: Feng Y, Yu Z, Tang M, Li J, Peng B, Juaiti M, Tang Y, Liang B, Ouyang M, Liu Q, Song J. Transcriptome-Wide N6-Methyladenosine Alternations in Pulmonary Arteries of Monocrotaline-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Rats and Novel Therapeutic Targets. Biomedicines. 2024 Feb 4;12(2) pii: biomedicines12020364. doi: 10.3390/biomedicines12020364. PubMed PMID: 38397966. 相关阅读: 项目集锦 | 易基因近期m6A甲基化(MeRIP-seq)研究成果 项目文章 | 90天见刊,易基因m6A RNA甲基化(MeRIP)+转录组组学研究 3文读懂:m⁶A甲基化在动物肌肉发育中的重要作用(猪+鸡+山羊) |
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