白木香通体结香技术现状及虫漏结香初探|侵染|多肉植物|沉香|白木香|真菌|结香

白木香通体结香技术现状及虫漏结香初探

张立宝等

白木香（Aquilaria sinensis）属瑞香科沉香属，因其所结香脂丰富，入水即沉而得名，又名土沉香、牙香树、女儿香、崖香、青桂香、莞香、芸香，当植物的树干受外界不良因素影响后留存的病理组织即为沉香，若所结香脂较少，不可于沉水，则称为黄熟香、栈香；一般为褐色至深黑色，且随颜色加深其品质也随之提高。分布于我国广东、海南、广西、福建、云南、台湾等低海拔山地和丘陵的常绿阔叶混交林中，被《中华人民共和国药典:2020 年版·一部》规定为国产沉香唯一的植物来源，是我国特有的名贵药源植物。白木香所结沉香具有调节中枢神经系统、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗抑郁、抗氧化、降血糖、调血脂、解热镇痛等活性，可用于治疗胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐呃逆、咳嗽、风湿、高烧、肾虚气逆喘急等症状，还对糖尿病、阿尔茨海默病等疾病有潜在的治疗作用，因此被历代名医追捧为上品药材。除此之外沉香又多被用于制成香或高级化妆品或具有收藏价值的工艺品等，叶片可制成茶叶冲泡饮用。

自然条件下，白木香结香率极低，人们对沉香的需求不断增长，随着野生沉香资源的掠夺式砍伐，加之生境的破坏，野生沉香树种濒危灭绝，急需通过人工结香技术提高结香效率与质量。现有研究成果表明：人工结香技术主要分为物理创伤法（凿洞法、砍伤法、火烙钉钉法、火烧树干法、断干或断枝法）、化学诱导（乙烯利、茉莉酸甲酯、水杨酸、氯化钠、甲酸、氯化亚铁、三氯化铁和亚硫酸钠）、人工接菌诱导（黄绿墨耳菌 Melanotus flavolives、镰刀菌Fusarium laseritum、可可毛色二孢菌 Lasiodiplodia theobromae、斑点青霉 Penicilluma meleagrinum、黑绿木霉 Trichoderma atroviride、拟康氏木霉 Trichoderma koningiopsis、青霉病病原菌 Penicilliumitalicum、腐皮镰孢 Fusarium solani、柑橘葡萄座腔菌 Botryosphaeria rhodina、拟层孔菌 Fomitopsissp.、葡萄座腔菌 Botryos rhodina）等方法诱导结香。但是现有结香方法都有不足之处，物理创伤法主要是通过不同方式对白木香树体进行人工物理伤害迫使白木香树体产生植物防御反应，在次生代谢的作用下产生的褐色至深黑色病理组织—沉香。不同的物理处理方式各有千秋，优点在于操作简单、成本低；缺点在于物理法结香结香速度慢，取香时间长，结香只聚集在伤口附近且产量有限，甚至会造成树体死亡。而化学法诱导结香极大提高了结香速度且操作简单，其主要利用化学试剂或其组合形式，诱导或迫使白木香产生胁迫反应进而产生沉香物质。不足之处在于所产沉香味道刺激性较强，价格低，当前还不被市场认可，而且使用的化学药剂是否会对环境造成污染、所产沉香能否达到国家药典要求、使用后对人体有无毒害等因素当前还尚不明确。人工接菌诱导结香是使用经过筛选的可诱导白木香产生沉香物质的内生真菌或外源真菌，此方法相较于二者进一步提高了结香效率，保障了结香质量，同时无任何化学添加剂不会对树体以及环境造成污染，是当前应用较为广泛的人工结香方式。

通体结香技术是魏建和研究员首先提出的白木香防御诱导反应结香假说[33]的基础上研发的世界领先的结香技术，为白木香结香机理提供了重大理论与现实价值，对白木香人工结香技术提供了强大的核心技术支撑，对解决沉香人工结香技术瓶颈，迈出了重要一步。本文根据白木香防御诱导结香机理，借鉴通体结香输液法原理自主研发了结香液，将结香液提前灌装至尖嘴瓶中，插入提前打好的孔洞中利用植物自身代谢作用使结香液通过木质部运送到树体各个部位，进而整树内部可诱导结香。同时还可利用蛀虫驻食作用携带结香液，以虫带菌形式进行侵染并与虫蛀和机械打孔两种结香方式形成对比来验证侵染效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 白木香基地概况 白木香基地位于云南省西双版纳傣族自治州纳板河自然保护区内，选取平均干径 20 cm 以上，树龄 15 年，树况良好的白木香树。

1.1.2 文献可视化分析数据 文献数据来源于 CNKI（http://www.cnki.net）数据库，截至 2023 年 2月 16 日共检索到文献 49 篇以“通体结香”为主题进行检索，所有检索结果导出为 Refworks 格式备用。

1.1.3 白木香结香诱导真菌及蛀干昆虫 本试验所用菌株均来自云南省林业和草原科学院森林保护研究所，内部编号为 YB-1、YB3-1、HLH、YML,现由云南省林业和草原科学院森林保护研究所保存；蛀干昆虫为天牛幼虫。

1.1.4 白木香结香液制备 白木香结香液是本课题组根据输液法结香原理，自主研发的利用可明显诱导白木香结香真菌接种于培养液的发酵液。利用剪切机对结香液中菌丝进行剪切，转速 15 000r/min，持续 2 min，以 15 mL/瓶的容量分装至特制尖口瓶中备用。

1.2 试验方法

1.2.1 文献可视化分析 利用 CiteSpace 6.1R6[34]将检索文献结果转换后，根据文献检索结果，设置分析时间为 2010 年 12 月至 2023 年 1 月，以关键词为分析目标，使用网络图裁剪（Pathfinder)与裁剪合并网络（pruning slice d networks）算法，其余默认。

1.2.2 白木香人工结香处理 机械打孔处理作为本试验 CK 对照，同时又是其他 3 个处理的前提，主要利用手持锂电钻距地面 50 cm，自下而上，间距 10～15 cm、行距 20 cm、钻径 10 mm、倾角45°打孔，孔深为干径的 1/3；结香液处理是直接将灌装好结香液的尖口瓶插入电钻打好的孔洞中即可；虫蛀处理是利用镊子将天牛幼虫直接放入孔中，并用保鲜膜围树干孔洞自下而上包裹防止其逃逸造成生物灾害，同时使用昆虫针在洞口扎眼保证通风通气，避免其窒息死亡；虫带菌处理不同与虫蛀处理的地方在于此处理需要使用镊子将桔褐天牛幼虫夹起在装有结香液烧杯中均匀蘸取 1～2 s，而后迅速放入孔中，其余均与虫蛀处理相同。每树为 1 个处理、且 3 个重复，统一编号并且树上挂牌标记（表 1）。

1.2.3 样品采样 人工结香处理 2 个月后，利用打孔器对树体结香部位取样，晾干后备用。

1.2.4 醇提物提取 每份样品称取 2 g 加入锥形瓶内，加入无水乙醇 50 mL 静置 1 h，随后置于水浴锅中以 80 ℃水温水浴萃取 1 h，将蒸发皿提前 3 h 烘干并称量空皿质量，立即加入滤后的萃取液 25m L，水浴锅蒸 1 h 后，测蒸发皿质量，随后计算醇提物含量。

1.2.5 数据分析与制图 试验结束 2 个月后对所有处理的侵染效果利用直尺进行测量并测算侵染面积（表 2）。根据试验数据利用 Graphpad prism 8.3.0 绘制白木香不同处理侵染面积图（图 2）。

表 1 白木香不同处理方式编号

打开网易新闻 查看精彩图片

打开网易新闻 查看精彩图片

表 2 白木香不同处理侵染面积

打开网易新闻 查看精彩图片

2 结果与分析

2.1 通体结香文献分析

根据 CiteSpace 分析结果显示（图 1），含有沉香、白木香、通体结香等关键词的文献数量较多，分别有 32、21、7 篇。表明通体结香技术主要应用于白木香，而结香方法、抗炎活性、化学成分、质量、药理作用、急性毒性、差异成分、质量评价、半倍萜等关键词占比较大，表明现有通体结香技术效率较低，所结沉香参质量差不齐，差异较大等问题依然突出，近年来分子组学等技术手段加速了结香机理的研究，但现有人工结香效率仍需改善，结香质量仍需提高，所结沉香醇提物含量是否满足国家《药典》要求以及明确结香机制尤为重要。

图 1 通体结香关键词聚类分析图

打开网易新闻 查看精彩图片

2.2 侵染效果分析

根据 Graphpad prism 8.3.0 对试验数据进行统计，根据试验结果可知，侵染面积由大到小依次为：虫带菌、虫、结香液、CK 对照。表明 CK 对照侵染面积最小且所有处理侵染效果都高于 CK 对照，具有加速结香效果；虫带菌处理整体侵染面积最大，说明虫带菌是本试验所有处理中最佳组合；虫蛀处理高于结香液处理表明加速树体结香的关键因素在于虫（图 2）。

图 2 白木香不同处理侵染面积图

打开网易新闻 查看精彩图片

2.3 醇提物含量分析

根据各人工结香技术所结沉香测得含量可知：所有处理沉香四醇含量均高于机械对照方式，说明 3 种人工结香方式可以促使白木香树体结香，并且相较于传统结香方式可加速结香，YB-1 以虫带菌结香方式所得醇提物含量要明显强于其他所有结香方式，表明 YB-1 是诱导白木香结香的优势菌株，同时与虫结合的虫带菌方式是最佳组合，而其余菌株与不同处理之间无明显差异。

图 3 沉香四醇含量

打开网易新闻 查看精彩图片

3 讨论

年度发文量是衡量某一学术领域研究进展的重要指标[35]，纵观通体结香最新研究成果发现，关键词“沉香”“白木香”“通体结香”频率最高；结香质量、药效作用以及结香技术与机理相关文献占比较大是时下热点研究内容。

通体结香技术所结沉香所含醇提物含量是影响结香质量的关键因素之一，而沉香四醇是醇提物主要成分之一，是鉴定真伪沉香的关键指标；沉香质量评价的研究主要集中在性状描述、显微鉴别、薄层鉴别、理化鉴别、浸出物含量、挥发油等方面[36-39]，所以提高通体香醇提物含量是当前点研究重内容之一；通体香的药效研究主要集中于调节肠胃动力，保护肝脏、心脏，镇静、抗炎等研究。然而现阶段结香机理尚未明确，当前主要倾向于白木香防御反应诱导结香假说，认为伤害或真菌侵染均是作为激发子诱导白木香产生防御反应的动因，进而迫使树体产生具有抑菌活性的防御物质，即药材沉香的主要化学成分，这些防御物质与细胞其他组分复合形成的侵填体堵塞了次生木质部的导管和维管束，以抵御外界物理、化学伤害或真菌侵染对白木香的进一步损伤[40]。但本研究具有一定局限性：CNKI 数据库与其他数据库相比，以“通体结香”为主题的文献较少，其次由于时间较短，所结沉香醇提物含量较少还未能达到《药典》要求。

通过本文研究发现结香液、虫带菌、虫 3 个处理方式相对于一般物理结香技术具都有促进作用，且虫带菌组合形式侵染效果最好，要强于结香液与虫蛀处理，表明虫带菌是最佳的诱导结香方法，真菌诱导结香本身具有结香速度快，结香质量高，所产沉香结香天然沉香的优点，加之钻蛀昆虫具有较强自主扩散能力，方便管养（人工饲养或助迁繁育），便于林间释放和人为管控，所里利用钻蛀昆虫协同真菌侵染的结香技术，效率会更加高效和快捷，侵染效果更加优越，诱导获得的沉香会更加天然优质，最终达到通体结香效果。如果能够探明昆虫蛀蚀协同真菌侵染诱导白木香结香的过程与机理，进而提出相应的“虫菌”结香技术或方法，这将是一项重大的结香技术革新。

现有结香方式虽然在一定程度上加快了结香效率与质量，但是整体依然存在产量低、周期长、品质参差不齐等现象，白木香结香的最佳效果为通体结香效果，业界普遍认为虫漏沉香是最优质的天然沉香，也是达到通体结香的最佳方式。目前关于虫漏沉香的报道中天牛、木蠹蛾、白蚁等昆虫可诱导白木香结香，因此本课题组为了知晓导致“虫漏”的主要昆虫及其伴生真菌的种类，利用昆虫、真菌或其伴生菌以及利用钻蛀昆虫携带结香高关联性真菌（比如：镰刀菌属 Fusarium sp.、青霉属 Penicillium sp.、木霉属 Trichoderma sp.、黄绿墨耳菌、可球二孢菌 Botryodiplodia sp.等）协同侵染诱导白木香结香，即通过人为干预，借助“昆虫+真菌”联合侵染诱导白木香结香。本文主要对通体结香技术研究现状进行分析，并以虫带菌诱导结香试验验证结香效果，以期最终达到通体结香的效果。