文章来源：中华内分泌代谢杂志, 2024,40(1) : 30-36 作者：李江雁 孔亚坤 赵建林 赵利超 熊承云 周艳红
糖尿病肾病(diabetic kidney disease, DKD)是2型糖尿病最常见的微血管并发症之一，也是目前终末期肾病最常见的原因之一，主要表现为尿白蛋白/肌酐比值≥30 mg/g和(或)估算的肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate, eGFR)<60 mL·min－1·(1.73 m2)－1(基于慢性肾病流行病学合作研究计算公式)[1]。血糖控制不佳引发的炎症应答、肾脏中固有免疫和适应性免疫系统诱导的免疫损伤均可能参与了DKD的发病[2,3]，但DKD的发病机制尚未完全阐明。 白细胞介素-36(IL-36)属于IL-1细胞因子家族，包含4种细胞因子：IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-36受体拮抗剂(IL-36 receptor antagonist, IL-36Ra)，IL-36受体是由IL-1受体相关蛋白2(IL-1 receptor related protein 2, IL-1RL2)和IL-1受体辅助蛋白(IL-1 receptor accessory protein, IL-1RAcP)组成的异源二聚体，IL-36受体表达于多种免疫细胞中，IL-36α、IL-36β、IL-36γ介导的信号通路可激活IL-36受体，通过调控炎症细胞应答发挥促炎作用，IL-36Ra可抑制IL-36受体功能，抑制炎症信号通路[4,5]。但有关IL-36细胞因子家族在DKD患者中的表达及其对单核细胞功能的调控尚未见相关报道。 因此，本研究首先分析了IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-36Ra在DKD患者中的表达谱，然后利用体外细胞培养系统观察重组人IL-36α对DKD患者单核细胞功能的调控作用。 连续入组2019年至2022年在新乡市中心医院确诊的2型糖尿病患者(2型糖尿病组)和DKD患者(DKD组)，同期选取在新乡市中心医院进行体检的健康人群(对照组)。本研究经新乡市中心医院伦理委员会审批(伦理批准号：2018-025)，受试者均对本研究知情同意，并签署知情同意书。2型糖尿病组入组标准：空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L或餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L；排除标准：1型糖尿病、妊娠期糖尿病、特殊类型糖尿病。DKD组入组标准：符合《中国糖尿病肾脏病防治指南(2021年版)》的诊断标准，尿白蛋白阳性、eGFR<60 mL·min－1·(1.73 m2)－1超过3个月；排除标准：其他因素导致的肾脏功能损伤。Ficoll淋巴细胞分离液(美国Sigma公司)；单核细胞分选试剂盒(德国美天旎公司)；脂多糖(美国赛诺菲公司)；重组人IL-36α(美国Peprotech公司)；酶联免疫吸附检测(ELISA)试剂盒[包括：IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-36Ra、颗粒酶A、颗粒酶B、颗粒酶H、IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)](武汉华美生物公司)；Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；PrimeScript反转录试剂盒、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(北京宝日生物技术公司)；IL-1RL2和IL-1RAcP实时定量PCR引物(美国Applied Biosystems公司，未提供序列)；抗CD14-FITC(克隆：M5E3)、程序性死亡受体-1(programmed death-1, PD-1;即CD279)-APC(克隆：MIH4)、抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T lymphocyte associated protein 4, CTLA-4；即CD152)-PE(克隆：BNI3)(BD Pharmingen公司)；乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒(武汉碧云天生物公司)。1．血浆和外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)分离：清晨空腹采集各组EDTA抗凝外周血20 mL，1 000×g离心10 min，收集上层血浆，冻存于－80℃备用；下层细胞使用Ficoll淋巴细胞分离液、采用密度梯度离心法分离PBMCs，调整细胞密度至107/mL，加入90%血浆＋10%二甲基亚砜，冻存于液氮中备用。随机选择9名对照者、19例2型糖尿病患者、15例DKD患者，每位受试者取107个PBMCs，1 000×g离心10 min，弃上清，加入30 μL分选缓冲液重悬，制备细胞悬液，加入10 μL Fc受体阻断剂和10 μL单核细胞生物素抗体鸡尾酒(Pan Monocyte Biotin-Antibody Cocktail，其中包含生物素标记的人单核细胞表面无表达的抗体混合物)，混匀后4℃孵育5 min，再加入30 μL分选缓冲液和20 μL抗生物素磁珠(Anti-Biotin Micro Beads)，混匀后4℃孵育10 min备用。将中型号(medium size, MS)分离柱放置于磁珠活化细胞分选(magnetic-activated cell-sorting, MACS)磁力分离架的分离区，向分离柱中加入500 μL分选缓冲液充分浸润，将抗体标记的细胞悬液加入浸润后的MS分离柱中，收集穿过分离柱的液体，内含纯化的单核细胞。对单核细胞进行计数，用于后续实验。3．单核细胞的刺激培养及与非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)共培养：单核细胞使用RPMI 1640＋10%胎牛血清，于37℃、5% CO2条件下培养，并加入脂多糖(10 ng/mL)刺激培养，同时向培养液中加入重组人IL-36α(5 ng/mL)刺激培养24 h，收集细胞和培养上清进行后续实验。使用RPMI 1640洗涤细胞2次，取104个刺激后的单核细胞，与105个Vero细胞共培养48 h，收集培养上清进行后续实验。使用商品化ELISA试剂盒检测血清IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-36Ra和培养上清颗粒酶A、颗粒酶B、颗粒酶H、IL-1β、IL-6、TNF-α水平。向抗体包被的平板中加入待测样本和标准品，每孔150 μL，室温孵育2 h，洗涤后加入200 μL抗体结合液，室温孵育2 h，洗涤后加入120 μL底物溶液，室温避光孵育30 min，加入120 μL终止液，室温孵育15 min后在450 nm处读取吸光度，根据标准品吸光度绘制标准曲线，计算待测样本中相关细胞因子水平。5．实时定量PCR法检测IL-1RL2和IL-1RAcP mRNA相对表达量：使用Trizol试剂提取单核细胞中的总RNA，分析RNA纯度并进行定量，使用PrimeScript反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA。使用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)进行实时定量PCR反应，反应体系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus) 10 μL、PCR上游引物(10 μmol/L)0.8 μL、PCR下游引物(10 μmol/L) 0.8 μL、ROX参考染料Ⅱ0.4 μL、cDNA模板2 μL、灭菌水6 μL，总体积20 μL。采用两步法PCR扩增标准程序：预变性1个循环95℃ 30 s；变性、退火延伸40个循环95℃ 5 s、60℃ 30 s。采用2－ΔΔCt法分析IL-1RL2和IL-1RAcP mRNA相对表达量。采用流式细胞术检测单核细胞中PD-1和CTLA-4平均荧光强度(mean fluorescence intensity, MFI)。使用抗CD14-FITC、抗PD-1-APC、抗CTLA-4-PE对单核细胞进行染色，4℃避光孵育30 min，洗涤后加入含2%多聚甲醛的PBS溶液固定，使用FACS Calibur流式细胞仪获取细胞，FlowJo V11软件分析结果。收集单核细胞与Vero细胞共培养后的上清，使用LDH细胞毒性检测试剂盒检测培养上清中LDH水平。以Vero细胞单独培养上清中的LDH水平作为'低水平对照'，以Triton X-100处理的Vero细胞培养上清中的LDH水平作为'高水平对照'，Vero细胞死亡比例(%)＝(待测样本－低水平对照)/(高水平对照－低水平对照)×100%。使用SPSS 23.0软件进行统计分析。计数资料采用率表示，采用卡方检验进行分析。计量资料首先分析正态性，对于符合正态分布的计量资料，采用 ±s表示，多组间比较采用单因素方差分析和SNK-q检验，2组间比较采用配对t检验，Pearson相关性检验进行相关性分析；对于不符合正态分布的计量资料，采用M(Q1, Q3)表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验和Dunn′s多重检验，2组间比较采用Wilcoxon配对检验，Spearman相关检验进行相关性分析。P<0.05表示差异有统计学意义。 结果
共入组对照组20名、2型糖尿病组41例、DKD组36例。3组在性别比例和平均年龄之间的差异无统计学意义。2型糖尿病组和DKD组FPG水平显著高于对照组，DKD组血尿素氮(BUN)、肌酐水平显著高于对照组和2型糖尿病组，DKD组eGFR水平显著低于对照组和2型糖尿病组(表1)。二、各组血浆IL-36细胞因子家族及单核细胞中IL-36受体亚基mRNA水平比较2型糖尿病组和DKD组血浆IL-36α水平显著高于对照组，尤以DKD组更高。2型糖尿病组和DKD组血浆IL-36β水平高于对照组，但IL-36β水平在2型糖尿病组和DKD组之间的差异无统计学意义。IL-36γ和IL-36Ra水平在对照组、2型糖尿病组、DKD组之间的差异无统计学意义(表2)。对照组和2型糖尿病组中IL-36α水平与FPG、BUN、肌酐、eGFR均无明显相关性(P>0.05)，DKD组中IL-36α水平与FPG、BUN、肌酐、eGFR亦无明显相关性(P>0.05，图1)。单核细胞中IL-36受体亚基(IL-1RL2和IL-1RAcP)mRNA相对表达量在3组之间的差异无统计学意义(表3)。图1 DKD患者血浆IL-36α水平与FPG(A)、BUN(B)、血肌酐(C)和eGFR(D)的相关性分析三、各组单核细胞分泌颗粒酶及细胞因子、免疫检查点分子表达水平及其杀伤功能的比较各组中分选的单核细胞使用脂多糖刺激培养24 h。DKD组单核细胞分泌颗粒酶B、TNF-α水平显著高于对照组和2型糖尿病组。2型糖尿病组和DKD组单核细胞分泌颗粒酶A、IL-6水平显著高于对照组，3组单核细胞分泌颗粒酶H、IL-1β水平的差异无统计学意义。DKD组单核细胞中PD-1和CTLA-4 MFI显著低于对照组和2型糖尿病组(P<0.05)。DKD组单核细胞诱导Vero细胞死亡的比例显著高于对照组和2型糖尿病组(P<0.05)，但Vero细胞死亡比例在对照组和2型糖尿病组之间的差异无统计学意义(P＝0.745，表4)。四、重组人IL-36α对DKD患者单核细胞功能的影响重组人IL-36α刺激后，DKD患者单核细胞分泌颗粒酶B和TNF-α水平显著升高，单核细胞诱导Vero细胞死亡的比例显著升高。但DKD患者单核细胞表面PD-1和CTLA-4 MFI在无IL-36α刺激和经IL-36α刺激之间的差异无统计学意义(表5)。 讨论
IL-36细胞因子家族可调控多种免疫细胞和非免疫细胞活性，参与多种炎症和自身免疫性疾病的发病[6]。既往研究发现，IL-36细胞因子家族成员参与了2型糖尿病的发病。2型糖尿病患者外周血IL-36α和IL-36γ水平升高，但IL-36Ra水平降低，IL-36α水平与超敏C反应蛋白水平呈显著正相关，与IL-36Ra水平呈显著负相关[7]。肥胖和肥胖相关2型糖尿病患者脂肪组织中IL-36γ水平升高，体脂率下降后脂肪组织中IL-36γ水平随之降低[8]。本研究发现了相似的结果，2型糖尿病患者外周血IL-36α和IL-36β水平升高，但IL-36γ和IL-36Ra在2型糖尿病患者中的表达无明显变化。这说明IL-36α和IL-36β可能参与2型糖尿病的发病。IL-36受体主要表达于免疫细胞、角质形成细胞和成纤维细胞[5,6]，而胰岛细胞中是否存在IL-36受体表达尚不清楚，因此，2型糖尿病中升高表达的IL-36α和IL-36β可能主要通过调控免疫细胞功能活性参与2型糖尿病发病。本研究与既往文献报告不一致可能与以下因素有关：(1)Frühbeck等[8]纳入的人群为欧洲人，而本研究纳入的人群为中国人，遗传背景存在一定差异，可能导致IL-36细胞因子家族表达谱不同；(2)本研究未考虑肥胖因素，亦未留存患者身高、体重等信息，未能以肥胖或体重指数作为指标对人群进行分组。 IL-36细胞因子家族亦参与了肾脏疾病的发病，对于维持肾脏功能稳态和炎症应答发挥重要作用[9]。狼疮性肾炎患者尿液中IL-36γ水平升高，与肾脏疾病活性相关[10]。IL-36γ和IL-36Ra组成性表达于小鼠肾脏中，自身免疫性肾炎小鼠模型中IL-36α、IL-36γ和IL-36Ra在肾脏中可诱导表达，其中IL-36α升高最为明显，主要表达于损伤的肾小管上皮细胞和活化的肾小球壁层上皮细胞中，IL-36β主要表达于肾脏间质浆细胞中，IL-36γ主要表达于肾交感神经轴突中，IL-36Ra主要表达于肾动脉血管中膜平滑肌细胞中，其中IL-36α介导的免疫失衡参与了自身免疫性肾炎的疾病进程[9]。IL-36α介导的信号通路可通过活化NLRP3炎症小体和IL-23/IL-17信号促进肾脏炎症和纤维化[11]。敲除IL-36受体可通过降低促炎细胞因子的表达使肾脏免受缺血再灌注损伤[12]。但有关IL-36细胞因子家族在DKD患者中的表达和功能尚未见相关报道。本研究发现，DKD患者IL-36α水平高于2型糖尿病患者，但IL-36α水平与血糖水平和肾脏功能指标均无显著相关性，这说明IL-36α可能是介导DKD发病的重要细胞因子之一。IL-36细胞因子在炎症应答中可发挥保护性和损伤性的双重作用，银屑病中IL-36细胞因子和成纤维细胞中IL-36受体表达均升高，IL-36信号通路可促进IL-23、IL-17分泌和中性粒细胞浸润，促进银屑病炎症进展[13]。相反，IL-36γ可促进炎症性肠病结肠黏膜损伤修复，IL-36受体基因敲除小鼠由于IL-36信号通路缺失，导致IL-22分泌减少，结肠黏膜损伤能力明显降低[14]。IL-36在炎症性疾病中发挥何种炎症应答作用与不同组织器官类型、病变性质、组织损伤程度、诱导刺激因素等有关[5]。升高表达的IL-36α在DKD疾病中发挥的作用仍有待进一步探讨。 单核细胞是固有免疫细胞中的重要成员，在抗感染、抗肿瘤和炎症应答中发挥重要作用。川崎病患者外周血单核细胞功能增强[15]，但慢性病毒性肝炎和肝癌患者中单核细胞杀伤功能受到抑制，无法清除病毒感染和肿瘤细胞，造成持续感染和肿瘤转移[16,17]。CD14＋、CD16＋双阳性单核细胞亚群具有促炎作用，与2型糖尿病和DKD患者组织微环境中的炎症应答密切相关[18]。单核细胞与高密度脂蛋白胆固醇比例在DKD患者中显著升高，是DKD发病的独立危险因素[19]。本研究显示，DKD患者单核细胞杀伤功能显著高于2型糖尿病患者和对照者，既往研究已发现，单核细胞在炎症应答中主要通过分泌以颗粒酶为代表的细胞毒性分子和以TNF-α为代表的促炎因子发挥杀伤功能[15]，而免疫检查分子作为负性调控分子可抑制单核细胞活性[15]。因此，DKD患者颗粒酶B、TNF-α水平升高以及免疫检查点分子表达降低说明DKD患者单核细胞的功能活性增强，可能参与了DKD的发病。既往研究发现，IL-36可增强M2型巨噬细胞分泌促炎细胞因子[20]，IL-36介导的炎症性单核细胞应答诱导急性淋巴细胞白血病的免疫抑制和化疗后复发[21]。由于本研究提示IL-36α在DKD患者中表达升高，因此，利用体外细胞培养系统评估重组人IL-36α对DKD患者单核细胞的调控作用。首先对单核细胞中IL-36受体亚基mRNA水平进行检测，但IL-36受体亚基mRNA水平在对照组、2型糖尿病组和DKD组之间的差异无统计学意义，未进行IL-36受体亚基蛋白水平检测，这是本研究的局限性之一。虽然IL-36受体表达没有变化，但IL-36α依然可以通过其受体介导的信号通路在细胞内募集髓样分化因子88[4]，激活下游信号通路，影响单核细胞功能。重组人IL-36α刺激后，DKD患者单核细胞诱导靶细胞死亡的比例升高，说明单核细胞杀伤活性增强，但IL-36α对单核细胞免疫检查点分子表达无明显影响，可促进颗粒酶B和TNF-α分泌增加，由于颗粒酶B不但可增加肾脏移植物免疫排异损伤[22]，还可直接造成肾小管损伤[23]，TNF-α也可直接造成肾脏炎症损伤[24]。提示IL-36α可能主要通过增加颗粒酶B和TNF-α分泌增强单核细胞功能活性，颗粒酶B和TNF-α也可能直接发挥促进肾脏损伤的作用。这一结果仍有待动物实验结果加以明确。 总之，DKD患者IL-36α水平升高可能与单核细胞杀伤活性增强密切相关，这一调控过程主要通过增加颗粒酶B和TNF-α分泌实现，IL-36介导的单核细胞活化可能参与了DKD的发病。
参考文献 （略）
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