【原】RNA的触手破译遗传密码！ ―tRNA修饰的新功能-

新闻发布会 研究2024 2024.03.28 RNA的触手破译遗传密码！ ―tRNA修饰的新功能- 发表要点 ◆在核糖体上合成蛋白质时，使用低温电子显微镜成功地将tRNA的碱基修饰解读mRNA的遗传密码的情况可视化。 ◆tRNA特有的胞苷修饰在核糖体上正确识别mRNA，高效合成蛋白质的机制已经明确。 ◆在阐明遗传密码的解读机构这一生命的基本原理这一点上是划时代的成果。 另外，将来也有望应用于合成生物学和tRNA制药。

长侧链tRNA的胞苷修饰在核糖体上识别mRNA 发布概述 东京大学研究生院工学系研究科的秋山奈穗研究生、铃木勉教授的研究小组，与理化学研究所生命功能科学研究中心的石黑健介访问研究员(研究当时，现:客座研究员/东京大学特任助教)、横山武司研究员(研究当时，现:东北大学助教)、白水美香子团队领导等人共同， 通过使用低温电子显微镜(注1 )的结构分析，明确了tRNA (注3 )修饰在核糖体(注2 )上解读AUA密码子(注4 )的结构。 tRNA含有各种各样的化学修饰，它们在进行蛋白质合成中起着重要的作用。 特别是在反密码子区域出现的修饰，通过赋予tRNA读取mRNA上密码子的能力，可以正确且高效地合成蛋白质。 细菌和细菌(古细菌)中，将AUA密码子解读为异亮氨酸( Ile )的tRNA(tRNAIle2)的反密码子第1个字(第34位)具有特征性的胞嘧啶修饰(注5 )。 细菌的tRNAIle2使用的是赖氨酸( l ) (图1、2 )，而acia的tRNAIle2使用的是被称为氮杂萘啶( agm2C ) (图1、2 )的胞苷修饰。 l和agm2C都具有在长侧链末端具有碱性官能团的特征化学结构，但在解读AUA密码子时它们起着怎样的作用尚不清楚。

长侧链tRNA的胞苷修饰在核糖体上识别mRNA 本研究使用低温电子显微镜，通过高分辨率的结构分析明确了细菌及载体的tRNAIle2在核糖体上解读AUA密码子的情况。 我们发现l和agm2C的胞嘧啶环在同一取向上与AUA密码子的第三个腺嘌呤碱基形成一个氢键(图1 )。 另外，观察到了l和agm2C的长修饰侧链向mRNA的下游延伸，末端的碱性官能团与AUA密码子旁边的残基氢键结合的情况(图1 )。 实际上，使用mRNA突变体的实验表明，如果不形成这个氢键，AUA密码子的识别效率会降低。 虽然知道各种各样的tRNA修饰对蛋白质合成的精度和效率很重要，但具体是以什么样的机制发挥其功能还不太清楚。 本研究在分子水平上阐明了细胞生长所必须的胞苷修饰是如何进行密码子解读的。 特别是发现tRNA修饰的侧链与mRNA的密码子以外的残基相互作用，是tRNA修饰的全新功能，可以说是阐明生命科学基本原理的成果。 发表内容 〈研究背景〉 将mRNA的碱基序列转换为蛋白质氨基酸序列的“翻译”是所有生物必须的过程。 翻译的准确度很大程度上取决于tRNA在核糖体上如何正确识别mRNA上的密码子。 在tRNA中进行密码子读取的3个字符的碱基序列被称为反密码子，受到各种各样的化学修饰。 特别是反密码子第1个字(第34位)的tRNA修饰通过控制密码子和反密码子的相互作用来决定tRNA的密码子识别能力(图2 )。 此外，在反密码子3’侧的相邻位点37位也有复杂的修饰，已知有使密码子-反密码子对稳定化的作用(图2 )。 迄今为止，在各种各样的生物中发现了各种各样的tRNA修饰，但对于它们到底如何参与密码子和反密码子的相互作用，目前的理解还没有进展。

图2 :读取aua密码子的tRNAIle2中存在的反密码子修饰 作为遗传密码的基本规则，第三个字是腺嘌呤或鸟嘌呤的密码子( NNA或NNG )，由第34位具有尿苷修饰的tRNA统一解读，翻译成同一种氨基酸。 但例外的是，由于AUA和AUG密码子由不同的tRNA分别解读，并分别翻译成Ile和蛋氨酸( Met )，所以人们知道这两个密码子是遗传密码中最难分辨的。 因此，生物利用tRNA修饰，建立了正确识别AUA和AUG的系统。 细菌和阿基亚等原核生物拥有专属阅读AUA密码子的tRNAIle2，在其第3~4位存在胞苷修饰( C* ) (图2 )。 细菌的tRNAIle2具有赖氨酸与胞嘧啶2位结合的l，而arcia tr naile 2具有精氨酸代谢物鸟嘌呤与胞嘧啶2位结合的agm2C (图2 )。 l和agm2C的化学性质都类似，因为它们的长链从胞嘧啶环延伸出来，末端有极性官能团。 但是，已知它们由完全不同类型的tRNA修饰酶导入，认为是细菌和载体从生命的共同祖先分支后，通过收敛进化(注6 )获得的tRNA修饰。 由于未修饰的tRNAIle2前体能接受蛋氨酸，且具有CAU抗密码子，因此识别AUG密码子并将其翻译成蛋氨酸，其行为就像蛋氨酸tRNA一样。 tRNAIle2经过修饰后，开始接受异亮氨酸，才能识别AUA密码子。 因此，l或agm2C修饰具有一次性切换tRNAIle2的氨基酸受体和密码子解读能力这两个性质的重要作用。 因为l和agm2C的修饰酶都被必需基因编码，所以已知这些tRNA修饰对于解读AUA密码子是必须的，对于维持生命是不可缺少的。 尽管是非常重要的tRNA修饰，但对于l和agm2C是以什么样的机制解读AUA密码子，还没有完全理解。 另外，在细菌、真菌、植物等tRNAIle2中，在与反义密码子相邻的第37位上添加了循环t6A(ct6A； 可以看到另一种tRNA修饰，即cyclic n6-threonylcarbamoyladenosine (图2 )。 ct6A虽然化学不稳定，但在细胞内有很高比例被导入tRNA中。 迄今为止，有报告称ct6A能提高密码子识别效率，但其机制尚不清楚。 另外，ct6A含有体积较大的乙内酰脲环(注7 )，这一特征性的化学结构如何与密码子解读相关，是一个令人感兴趣的课题。 〈研究内容〉 本研究从大肠埃希菌和巴氏杆菌一种Haloarcula marismortui中分离纯化tRNAIle2，与含AUA密码子的mRNA和核糖体形成复合物，经低温电镜( 300kV )检测2.3~2.7 ( on 发现在核糖体的a位点(注8 )，l和agm2C的胞嘧啶环均与AUA密码子第三个字的腺嘌呤( A3 )形成一个氢键介导的C-A碱基对(图3A )。 在该配对方式中，l或agm2C的修饰侧链与AUG密码子第三个字的鸟嘌呤( G3 )在空间上碰撞，因此被认为妨碍了AUG密码子的误识别。 此外，l和agm2C的修饰侧链向mRNA的下游( 3’侧)延伸，观察到其末端的极性官能团与邻接AUA密码子的残基核糖2’-羟基追加形成氢键(图3A )。 此外，还表明agm2C通过末端的胍基与a部位周边的核糖体RNA(rRNA )形成氢键，使密码子-反密码子对更加稳定(图3A )。 这些相互作用被认为有加强这种弱配对的作用，因为C-A碱基对只有一个氢键。 另外，研究还表明，在细菌和载体中保存着AUA密码子的识别机制。

图3 :基于胞苷修饰的高效AUA密码子识别机制 ( a )识别AUA密码子赖氨酰胺( L34 )； 左)、阿维菌素( agm2C34； 右边)的结构。 ( b )大肠杆菌tRNAIle2的AUA密码子结合效率。 对与AUA密码子相邻的第4个mRNA 4的2'-羟基进行了置换。 数据用平均值±标准偏差表示( n=5)。 * p < 0.01 ( two-tailed student’s t-test ) 为了研究l和agm2C修饰侧链与mRNA的相互作用实际上是否对AUA密码子识别产生影响，我们使用置换了AUA密码子的3’相邻残基的化学合成mRNA，评价了tRNAIle2在核糖体上的AUA密码子结合效率(图3B ) 在3’相邻残基的核糖上加入2’-脱氧基和2’- o -甲基的取代后，tRNAIle2与AUA密码子的结合率显著降低(图3B )。 另一方面，发现将同一位置置换为2’-氟基时，与天然的mRNA一样，会很好地与AUA密码子结合(图3B )。 2’-脱氧基和2’- o -甲基阻碍与极性侧链的氢键，2’-氟基作为氢键的受体发挥作用，因此被认为与极性侧链的氢键成为可能。 这些结果强烈提示，通过胞苷修饰的极性侧链和与密码子相邻的mRNA残基的相互作用，tRNA可以高效地解读AUA密码子。 虽然胞苷修饰是生命必需的tRNA修饰，但在AUA密码子的解读方面起着怎样的作用尚不清楚。 在l和agm2C胞苷修饰中，如果将伸出mRNA下游的碳链部分比作"链"，将与周围的mRNA和rRNA形成氢键的末端的极性基团比作"锚"，则tRNA会锚定在核糖体上，识别AUA密码子 这样的tRNA修饰功能是史无前例的，是推翻传统概念的发现。 并且，通过这次的结构分析，也成功地将大肠杆菌tRNAIle2的第37位上存在的ct6A修饰可视化了。 ct6A的乙内酰脲环采取与腺嘌呤碱基部分大致位于同一平面的结构(图4A )。 从该结果可以认为，ct6A通过将庞大的乙内酰脲环很好地收敛在反密码子环内，与周边的碱基( A38等)产生堆积效果(注9 ) (图4B )，具有使密码子-反密码子相互作用稳定化的效果

图4:37位ct6A修饰的结构( a ) ct6A37的结构。 乙内酰脲环与腺嘌呤碱基大致位于同一平面。 ( b ) ct6A37与外围U36-A1(mRNA ) (左)和A38 (右)的堆栈。

〈今后的展望〉 本研究的成果接近了遗传密码中也难以分辨的AUA密码子的解读机制之谜，可以说是在分子水平上明确了蛋白质合成的基本结构和tRNA修饰的功能的成果。 今后，通过对人类和其他生物种类中出现的tRNA修饰也进行同样的分析，理解遗传密码破译机构的整体情况是很重要的。 主讲人 东京大学研究生院工学系研究科化学生命工学专业 秋山奈穗博士课程/日本学术振兴会特别研究员 铃木勉教授 理化研究所生命功能科学研究中心蛋白质功能结构研究小组 白水美香子队队长 论文信息 〈杂志〉nature structural & molecular biology 〈题名〉structural insights into the decoding capability of isoleucine trnas with Lys idine and agmatidine 〈作者〉Naho Akiyama，Kensuke Ishiguro，Takeshi Yokoyama，Kenjyo Miyauchi，Asuteka Nagao，Mikako Shirouzu，*Tsutomu Suzuki 〈doi〉10.1038/s 41594-024-01238-1 研究资助 本研究由日本学术振兴会JSPS的特别研究员奖励费“原核生物中解读AUA密码子的分子基础”(代表:秋山奈穗，23KJ0409 )、基础研究( s )“RNA表观遗传学与高次生命现象”(代表:铃木勉，26220205 )、基础研究 18H05272 )、新学术领域·研究领域提案型“ncRNA的化学分类”(代表:铃木勉，26113003 )、以及科学技术振兴机构( JST )的战略性创造·研究推进事业( ERATO )“铃木RNA修饰生命功能项目”(研究总结: ) 用语解说 (注1 )低温电镜 一种电子显微镜，可以在低温下(约-200℃)向生物分子的试样照射电子束，观察其结构。 通过将试样在水溶液中瞬间冻结，可以在接近生物体内的环境中进行目标分子的结构分析。 (注2 )核糖体 是由RNA和蛋白质组成的复合体，是蛋白质合成的场所。 由大小两个亚基组成，大亚基起着肽基转移反应的重要作用，小亚基起着监测mRNA与tRNA之间密码子对的作用。 (注3 ) tRNA 转移RNA。 在蛋白质合成中，作为使密码子和氨基酸对应的衔接分子发挥作用。 70〜90个碱基长短的单链RNA，二级结构采用特征性的三叶草叶样结构，将其折叠后形成l字型的立体结构。 tRNA接受3’末端对应的氨基酸，对应20种氨基酸存在不同的tRNA种类。 tRNA具有与密码子相对应的反密码子，通过在核糖体上与mRNA (传令RNA )上的密码子结合，将对应的氨基酸导入伸长中的蛋白质中。 (注4 ) AUA密码子 密码子是由RNA的4种碱基( a，u，g，c )三键组成的遗传密码单位，存在4×4×4=64种密码子。 各密码子指定了构成蛋白质的20种氨基酸及蛋白质合成的结束。 AUA密码子指定异亮氨酸，后文提到的AUG密码子指定蛋氨酸。 (注5 )胞苷修饰 胞苷是构成RNA的4种核苷之一，指修饰的胞苷。 (注6 )收敛演化 不同系统的生物和生物分子进化成相似形态的现象。 例如，哺乳动物海豚和鱼类鲨鱼获得了相似形状的尾鳍以适应它们在水中的生活。 (注7 )乙内酰脲环fig05 杂环式结构的一种。 是ct6A修饰中所含的分子骨架。(注8 ) a部位 核糖体上tRNA结合的三个部位之一。 a部位与氨基酰基tRNA结合，在这里tRNA的反密码子识别密码子，进行遗传密码的解读。 (注9 )堆叠效果 两个芳香环重叠放置时产生的相互作用。 芳香环的π电子之间重合产生分子间力，具有使其配置稳定化的效果。 新闻稿正文: PDF文件nature structural & molecular biology:https://www./articles/s 41594-024-01238-1