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题目：Suppressing ASPARTIC PROTEASE 1 prolongs photosynthesis and increases wheat grain weight 刊名：Nat. Plants 作者：Ke-Xin Niu, Jin-Ying Gou et al. 单位：China Agricultural University, Beijing 日期：05 June 2023    01 摘要  本文报道了小麦CO2同化与籽粒增强基因2（cake2）的克隆、光合优势的形成机制以及适合选育优良品种的自然等位基因。 天冬氨酸蛋白酶1（APP-A1）基因A基因组拷贝中的提前终止突变提高了光合速率和产量。 APP1结合并降解PsbO，PsbO是光系统II的保护性外源成员，对提高光合作用和产量至关重要。 普通小麦APP-A1基因的自然多态性降低了APP-A1的活性，促进了光合作用和粒径及粒重。 本研究表明，APP1基因的修饰提高了水稻的光合作用、粒径和产量。这些遗传资源可以促进四倍体和六倍体小麦优良品种的光合作用和高产潜力。 02 技术路线  The EMS mutants and transgenic lines used in this work were in the Triticum turgidum (tetraploid, AABB genome) Kronos ecotype back ground. Bulked segregant analysis to clone CAKE2 Recombinant protein purification and APP1 activity analyses Subcellular localization and transgenic plants Protein–protein interaction assays Molecular modelling prediction of APP-A1 and haplotypes According to an earlier report, we transformed the above plasmid into Kronos (WT) immature embryos with Agrobacterium to overexpress APP-A1 in wheat 03 主要结果 3.1 cake2基因的克隆 植物利用太阳辐射通过光合作用吸收CO2是谷类作物汇（或籽粒）中能量储存的驱动力。上个世纪的小麦育种实践证明，增加粒重有助于提高产量潜力，是未来小麦育种计划的重要目标。 为了研究小麦产量的内在机制并获得影响产量的遗传物质，我们从四倍体小麦EMS突变体库19中分离到了cake2突变体。cake2突变体在灌浆期旗叶中表现出staygreen表型（图1a）。在野生型（WT）植物中，叶尖失去了大部分叶绿素并变黄，但在cake2突变体中，叶尖保持绿色（图1b）。与WT相比，cake2突变体的叶绿素含量增加（图1c）。由于一些staygreen突变体（例如ossgr）在光合能力方面没有优势，我们比较了cake2突变体与WT的CO2同化率。cake2突变体的净光合速率比WT高20%，呈现出非常显著的增加（图1d）。cake2突变体叶片光合作用的增加可以从理论上为籽粒提供更多的代谢通量，从而导致籽粒变宽（图1e）。cake2突变体的晶粒比WT的重（图1f）。上述结果表明，cake2突变体具有功能性staygreen表型，在净光同化率、粒径和粒重等方面具有优势。 我们将cake2突变体与WT回交三次，分离出BC3F2纯合子代克隆相应基因。我们对BC3F3叶片上的RNA-seq数据进行了批量Segrent分析。在这三个样本中只有一个常见的单一非对称纯合SNP（图1g）。该SNP将G（tgG）转化为a（tgA），并在编码509个氨基酸残基的天冬氨酸蛋白酶（APP1，下文）的六倍体小麦中国春（图1h）基因组序列中对应于TRAESCS1A02G0404500.1的基因座上产生早熟终止密码子（W225*）。APP1属于小麦天冬氨酸蛋白酶基因家族的Asp亚家族。它是在大多数组织中高度表达的管家Asp基因之一。cake2突变体中的早熟终止密码子（W225*）删除了天冬氨酸蛋白酶的两个活性位点中的一个，理论上可以破坏APP1的特异酶活性。
图1 | cake2的表型和分子克隆。 a、 cake2籽粒灌浆期的staygreen表型。 b绿叶灌浆期旗叶的比较。 （c）和CO2净同化率（d）净光合速率。 e、 f，田间条件下cake2和WT籽粒大小和平均重量的比较 h、 SNP对相应基因编码蛋白的影响 i、 APP1基因结构示意图和突变在cake2（红三角）中的位置。 3.2 app-A1作为CAKE2基因的遗传验证 为了研究APP-A1的功能缺陷与cake表型之间的相关性，我们搜索了Kronos EMS突变体文库21，并在chro-mosome 1B的同源基因（APP-B1）中鉴定了一个剪接突变体。APP-B1第六内含子中的剪接区域包含一个SNP，导致内含子片段保留，该SNP引入两个提前终止密码子并删除天冬氨酸蛋白酶的两个活性酶位点中的一个。我们将该突变体命名为app-B1，将其与WT回交三次以去除背景突变，并将其与cake2 BC3F3（app-A1）纯合突变体杂交以创建敲除突变体app1。app-B1和app1敲除突变体在灌浆期表现出staygreen表型（图2a）。在app-A1、app-B1和APP1敲除突变体中，内源性APP1显著下降（图2b）。此外，这些突变体中天冬氨酸蛋白酶的比活性显著降低（图2c）。这些结果表明，根据许多组织中的基因表达模式，APP1在APP基因家族中起着关键作用。 为了探讨staygreen表型的形成机制，我们提取了叶绿体，并分析了光系统的蛋白复合物（PSⅠ和PSⅡ）。完整的PS II超复合物在app-A1、app-B1和app1敲除突变体中显著积累，但不含PsbO的PS II（[PS II]）没有（图2d）。上述突变体的总叶绿素含量显著高于野生型（图2e）。光系统超复合物和叶绿素的积累导致上述突变体的净光合速率显著增加（13%～25%）（图2f）。app-A1、app-B1和app1敲除突变体中持续的活跃光合作用为库提供了额外的代谢通量，从而增加了粒径（图2g）。app-B1和app1敲除突变体显著增加了粒重，类似于cake2（图2h）。与app-A1不同，app-B1突变体产生了更宽的晶粒。app1敲除突变体的粒宽进一步增加（图2j）。对于晶粒厚度，app-A1、app-B1和app1敲除突变体显示显著增加（图2k）。这些结果表明，APP1同源异型体的功能失调也延长了CO2同化时间和增加了粒重，支持了app-A1突变与cake2表型之间的遗传相关性。
h–k，平均重量（h，n = 8） ，长度（i，n = 25），宽度（j，n = 25）和厚度（k，n = 25）来自WT和app-A1、app-B1和app1敲除突变体。 3.3 APP1负调控CO2同化率和粒重。 app-A1、app-B1和APP1敲除突变体的staygreen表型表明，干扰APP1足以增强光合作用。我们预测APP1可能对叶片光合酶产生伤害。为了验证这一假设，我们在玉米泛素启动子（ProUbi：：APP1）的驱动下整合了APP-A1的全长cDNA，并将其转化到WT（Kronos）植株中。ProUbi：：APP1转基因系（APP1 OE后文）表现出早期衰老表型（图3a）。在APP1 OE转基因株系中，APP1的蛋白质含量始终积累在较高水平（图3b）。由于APP1负调控衰老，APP1 OE转基因株系含有较少的叶绿素（图3c）。它们的净光合速率比WT低9%至20%，表明显著降低（图3d）。光合特性的下降直接影响到转APP1 OE基因系的籽粒。由于来源的限制，APP1 OE转基因株系产生更小的籽粒（图3e）。APP1 OE转基因系的平均粒重较低（图3f）。APP1 OE转基因株系的平均粒长与WT株系的无差异（图3g）。然而，APP1 OE转基因系的平均粒宽和厚度显著较低（图3h，i）。上述趋势与cake2突变体相反，后者增加了晶粒宽度和厚度（图1e，f）。我们将APP1 OE转基因株系与cake2突变体杂交，建立了互补株系（APP1 OE/app-A1）。APP1 OE事件恢复了cake2突变体的staygreen表型（图3j），这与APP1蛋白含量的变化一致（图3k）。APP1蛋白的增加补充了WT的叶绿素含量和光合速率（图3l，m）。此外，APP1 OE事件显示cake2突变体籽粒表型的完美遗传互补，包括粒重、长度、宽度和厚度（图3n–r）。这些遗传数据表明，APP1与小麦CO2同化率、粒径和粒重呈负相关。
图3 | APP1 OE加速叶片衰老并补充cake2。 a、 APP1 OE植株和旗叶的早期衰老表型。 b、 WT、app-A1和APP1-OE转基因株系内源APP1的含量。 c、 d，叶绿素（c）和净CO2同化率（d）在WT、app-A1和APP1 OE转基因系中。 e、 来自WT、app-A1和APP1 OE转基因系的籽粒。 f–i，平均重量比较（f），长度（g），宽度（h）和厚度（i）来自WT、app-A1和APP1 OE转基因系的籽粒。 j、 k，WT、app-A1和APP1 OE/app-A1互补系的衰老表型和内源APP1蛋白含量。 l、 m，总叶绿素含量比较（l）和净CO2同化率（m）在WT、app-A1和APP1 OE/app-A1互补系中。 n、 来自WT、app-A1和APP1 OE/app-A1互补系的晶粒。 o–r，平均重量比较（o），长度（p），宽度（q）和厚度（r）来自WT、app-A1和APP1 OE/app-A1互补系的晶粒。 3.4 APP1结合并降解PsbO 光合作用超级复合物的分析显示，完整PS II增加，但[PS II]没有增加（图2d）。【PS II】也称为“裸PS II”，它失去了外部成员，如PsbO。PsbO稳定活性位点锰簇并积极调节PS II的稳定性和活性。我们先前的研究鉴定了一个内源PsbO蛋白含量较低的小麦PsbO EMS突变体（PsbO-A1）。psbo-A1突变体表现出早衰phe型和显著的粒径和重量缺陷。 在植物细胞中，APP1–GFP融合蛋白的荧光信号与叶绿体的自发荧光重叠（图4a）。因此，将PsbO预测为APP1下游目标之一是合乎逻辑的。APP1具有蛋白酶活性以降解其相互作用蛋白靶点。第102和290天冬氨酸残基是天冬氨酸蛋白酶基因家族中保守的酶位点（图4b）。Asp是APP1在类囊体中的成熟形式，包括一个完整的天冬氨酸蛋白酶结构域（图1i）。因此，我们将这些残基突变为丙氨酸残基，并创建D102A（Aspm1）、D290A（Aspm2）和D102A/D290A（Aspm1m2）突变体以抑制Asp的天冬氨酸蛋白酶活性。 在酵母双杂交系统中，Asp与叶绿体中成熟形式的PsbO（mPsbO，80至325个氨基酸）相互作用（图4c）。原核纯化的Asp蛋白和上述突变体成功地从野生型植物的总叶提取物中提取了PsbO蛋白。然而，在含有酶死亡的Asp突变蛋白的样品中，PsbO蛋白比含有活性Asp的样品中的PsbO蛋白更多（图4d）。与上述半下拉结果类似，酶死亡的Asp突变蛋白产生的信号比具有mPsbO的活性Asp产生的信号更强（图4e）。这些结果支持了Asp与PsbO在体内外的蛋白质相互作用，表明活性Asp对PsbO有不良影响。 根据酶死亡的Asp突变体和活性Asp之间的差异（图4d，e），我们预测APP1可以降解PsbO。在小麦叶绿体中，app-A1、app-B1和app1敲除突变体的内源PsbO含量高于WT（图4f），表明app1功能障碍足以增强PsbO的蛋白质稳定性。原核纯化的PsbO蛋白经植物总蛋白快速降解30 分钟。然而，天冬氨酸蛋白酶的特异性抑制剂胃蛋白酶抑素A（Pep A）延迟了消化过程（图4g），表明APP1的天冬氨酸蛋白酶在降解PsbO中起主导作用。虽然APP1对PsbO的稳定性有显著的调节作用，但在这个过程中除APP1外，还有其他的调节作用。leupeptin（抗丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸蛋白酶）和E64（抗半胱氨酸蛋白酶）的混合物阻断app-A1、app-B1和app1敲除突变体中的PsbO降解（图4h）。 这些数据表明，多种蛋白酶降解小麦中的PsbO。leupeptin、E64和Pep A的混合物甚至阻断了WT样品中PsbO的降解（图4h），这进一步证实了APP1在体内降解PsbO。
3.5 PsbO对app1光合作用的促进作用 上述蛋白质相互作用和降解过程支持PsbO作为APP1的目标之一。转录组数据揭示了app-A1突变体中一系列差异表达的基因，包括蛋白质靶向和蛋白质定位到叶绿体的建立。PsbO的表达水平明显高于WT，反映出正反馈调节。 为了研究PsbO在app-A1在光合作用和粒重方面的优势中的作用，我们将PsbO-A1与app1敲除突变体杂交以产生三重突变体app1/PsbO-A1。psbo-A1突变减弱app1敲除突变体的staygreen表型（图5a）。这一结果表明PsbO稳定对app1敲除突变体的staygreen表型有显著贡献。app1基因敲除突变体的叶绿素含量增加了23%，而psbo-A1突变体的叶绿素含量降低了46%。app1/psbo-A1三重突变体的叶绿素含量介于app1敲除突变体和psbo-A1突变体之间（图5b）。app1/psbo-A1三重突变体的CO2同化率与psbo-A1相似（图5c），支持psbo在光合作用中的作用。app1/psbo-A1三重突变体表现出优于psbo-A1突变体的优势，表明psbo-B1或其他隐藏靶点也有助于app1敲除突变体光合作用的增强。 进一步比较了PsbO对籽粒发育的影响。app1/psbo-A1三重突变体产生的晶粒大小介于app1敲除和psbo-A1突变体之间（图5d）。app1/psbo-A1三重突变体的最终粒重接近WT（图5e）。详细的测量表明，PsbO对许多籽粒表型有贡献，包括app1敲除突变体的籽粒长度、宽度和厚度（图5f–h）。
3.6 模拟app1促进光合作用和粒重的自然变异 cake2和app1基因敲除突变体是未来育种的理想材料。为了研究模拟cake2突变体效应的潜在多态性，我们利用基因组重测序数据分析了小麦群体中的自然变异。我们将参考基因组（Chinese Spring v.1.1）中的App-A1等位基因（Ser442）命名为WT（App-A1-HapI）。App-A1基因（Gly442）中存在自然变异（App-A1-HapII），改变了预测的APP1蛋白质结构中的螺旋（图6a）。除S442G突变外，APP-A1基因编码区存在4个错义变异。我们获得了APP-A1基因中仅有HapI或HapII变体的所有可获得品种，每个品种使用单个籽粒进行繁殖，并在田间条件下以完全随机分布设计进行单行种植。具有App-A1-HapII变体的品种产生的籽粒在粒重、长度、宽度和厚度方面显著增加（图6b-e）。在田间试验中，具有App-A1-HapI变体的品种比具有App-A1-HapI变体的品种产生更多的籽粒（图6f）。 这些数据表明App-A1-HapII变异与籽粒发育可能正相关。接下来，我们选择一个App-A1-HapI品种（郑麦9023（ZM9023））和一个App-A1-HapI类型（扬麦5号（YM5））进行遗传分析（图6g）。ZM9023（App-A1-HapII）旗叶积累较少的APP1蛋白（图6h），这部分模拟了突变体中APP1的减少。有趣的是，App-A1-HapI品种含有更多的叶绿素（图6i），并且具有比App-A1-HapI（图6j）更高的光合速率。将ZM9023与YM5杂交，对分离后代进行分析。App-A1-HapI品系比App-A1-HapI变体产生的晶粒更大（图6k）。App-A1-HapII品系的粒重增加非常明显（图6l）。粒重增加的原因是粒宽和粒厚增加，而不是粒长增加（图6m–o）。这一趋势与自然种群的差异相似。因此，App-A1-HapII变异体模仿EMS诱导的突变引起的APP1功能障碍，并有可能被纳入未来的优良品种。
04 结论  在本研究中，我们分离到一个具有staygreen表型和较大籽粒的小麦CO2同化和籽粒增强型2（CAKE2）乙基甲烷磺酸（EMS）突变体。我们在1A染色体上发现了一个纯合子单核苷酸多态性（SNP），该多态性导致天冬氨酸蛋白酶1（APP-A1，对应于中国春季基因组序列中的TRAESCS1A02G0404500.1基因）的过早终止突变，并删除了天冬氨酸蛋白酶保守的活性位点。 APP-B1同源基因中的剪接突变体（APP-B1）和双突变体app1支持了app1功能障碍与CO2同化率和粒径的相关性。APP-A1结合并降解PsbO，PS II的外部成员。psbo-A1突变部分恢复了app1双突变体的延迟绿色表型。此外，APP-A1的一个自然有利等位基因增加了天然小麦群体的CO2同化和粒重。 本研究揭示了功能性staygreen的调控及其对粒重的贡献。小麦APP1的EMS突变和有益等位基因可整合到面食小麦或面包小麦中，以培育高产优质品种。 05 原文获取 原文链接： https://onlinelibrary./doi/10.1111/tpj.16616 PDF获取： https://www./h-nd-324.html |
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