流式检测常见问题分析及解决方案！

根据经验的积累，小编结合案例对流式检测的常见问题和解决方案做了补充，具体如下：

无信号/荧光强度弱

1. 信号补偿不正确：

检查流式细胞仪上单色阳性对照是否设置正确，以及门控和补偿设置是否正确，确保能捕获所有事件。

2. 补偿过高/增益过低：

使用阳性对照正确设置流式细胞仪，利用补偿确保细胞的荧光信号不被切断，提高增益以增强信号（在合理范围内，应谨慎操作）。

3. 抗体问题：

抗体可能存放太久或没有避光，导致荧光淬灭。此外，一抗和二抗可能不匹配，应确保使用的二抗与一抗来源种属不同。

选择一抗（主要抗体）和二抗（次要抗体或荧光标记抗体）时，必须考虑它们的种属特异性。下面是一个根据不同种属差异选择一抗和二抗的示例表格：

在选择一抗时，需要根据目标抗原和种属特异性来挑选。例如，如果要检测小鼠细胞上的抗原，则应该选择小鼠特异性的一抗。

在选择二抗时，需要确保二抗能够识别一抗的来源。例如，如果一抗是小鼠来源的IgG，那么二抗应该是抗小鼠IgG的。此外，二抗通常带有荧光标记（如FITC、PE、APC等），以便于在流式细胞仪上检测。

荧光强度高

1. 抗体工作浓度过高：

摸索抗体最佳使用浓度，做抗体滴定实验，减少每个样本中添加的抗体量，以避免强非特异性结合或高荧光强度。

2. 非特异性结合：

抗体的非特异性结合能力较强，增加FC受体封闭试剂，减少抗体FC段对细胞表面FC受体的非特异性结合。

样本处理不当

1. 细胞固定和透化：

不适当的固定和透化条件可能导致细胞结构破坏，从而影响抗原与抗体的结合。因此，应根据所使用的抗体和细胞类型优化固定和透化条件。

2. 细胞存活率问题：

如果样本中存在大量死细胞，可能会影响流式结果。确保样本处理过程中细胞的存活率，并在流式分析时设置适当的门控来排除死细胞。

3. 样本污染：

确保样本在处理和存储过程中无污染，包括细菌、真菌和其他污染物。

多色流式实验中的颜色重叠

在进行多色流式实验时，不同荧光染料之间可能存在颜色重叠的问题。这可能导致信号间的干扰和误读。为了避免这种情况，应选择光谱重叠较小的荧光染料，并使用流式细胞仪的补偿功能来纠正染料间的干扰，根据所要检测指标的表达强弱配置合适荧光强度的荧光素标记抗体。

样本间的批次差异

不同的样本批次之间可能存在差异，如细胞密度、细胞大小、抗原表达水平等。这些差异可能影响流式结果的准确性和可重复性。为了减少批次差异，建议在实验设计中包含相应的对照样本，并使用标准化方法来处理和分析数据。

非特异性结合

在流式实验中，非特异性结合是一种常见的干扰因素。这可能导致背景信号升高，影响对抗原表达的准确测量。为了减少非特异性结合，可以使用封闭剂（如FCS、BSA等）来封闭抗体与细胞表面非特异性结合位点，并优化抗体的浓度和孵育时间。

背景噪声

背景噪声是流式实验中另一个需要注意的问题。它可能来自于仪器本身、样本处理过程中的污染、非特异性结合等因素。为了减少背景噪声，需要保证实验环境的清洁和无菌操作，使用高质量的试剂和耗材，并合理设置仪器的参数和阈值。

样本处理和保存

样本的处理和保存对流式细胞术实验的结果有着显著影响。不正确的样本处理可能导致细胞死亡、抗原丢失或降解。因此，需要遵循严格的样本处理流程，包括正确的采集、运输、保存和标记样本。对于需要长期保存的样本，应使用适当的保存方法和条件，如低温冷冻、添加保护剂等。

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晶莱生物（GENELINE Co., Ltd）创立于2016年，拥有北京（北京晶莱华科生物技术有限公司）及长沙（湖南晶莱生物技术有限公司）两个研发机构，是专注于生物医药临床期前研发与基础医学科研服务的高新技术企业。依托北京、长沙两地的3000余平实验平台，晶莱构建了8个研究平台，能提供动物寄养、动物模型构建、细胞模型构建，药效研究，各类表型、机制、通路等研究服务。

晶莱可开展小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔、犬、猪、猴相关的动物实验，可构建200余种动物疾病模型。