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导语

结果：

与DN诱导的小鼠肾损伤和RA治疗相关的单细胞特征

为了评估RA对DN的影响，作者对冷冻保存的肾脏组织进行了scRNA-seq和质谱学的蛋白质组学分析，这些组织样本来自正常小鼠（正常组）、DN模型（DKD组）和RA治疗的DN（DKD_RA组）样本（scRNA测序有6个样本的3个队列；蛋白质组学分析有9个样本的3个队列）。图1A展示了实验流程。随后，作者收集了正常组、DKD组和DKD_RA组的样本进行scRNA和蛋白质组学测序及下游分析。此外，作者观察到DN小鼠的肾脏组织中出现了管腔上皮的空泡退化等组织病理学变化（图1B）。值得注意的是，RA治疗后，DN引起的肾脏损伤在一定程度上得到了减轻。

对RA治疗的细胞异质性

为了揭示这些细胞变化背后的分子机制，作者使用Seurat的FindMarker来识别每种细胞类型的差异表达基因（DEGs）。根据在DKD vs. Normal和DKD_RA vs. DKD这两个比较中检测到的上调或下调的DEGs的分布模式（支持信息图S2A和S2B），作者观察了免疫细胞，特别是Mφ的DEGs的表达谱（图S2C-S2G）。值得注意的是，作者的分析显示，在RA处理后，PT表现出最多的DEGs，其次是ALH（如图S2H所示）。此外，大多数DEGs主要存在于单个细胞类型中（图S2G和S2H），突显了细胞对RA处理的异质性反应。有趣的是，PT显示出RA处理后被拯救的基因数量最多，其次是ALH，而在Neutro、B和Podo细胞中没有发现被拯救的基因（图2A）。此外，作者观察到一些被拯救的基因，如Atox1、Abca1、Nfkb1和Il1b，涉及氧化应激和炎症（图2A和B）。与炎症相关的功能途径，包括通过NF-κB的TNF-α信号传导、氧化磷酸化和凋亡，在RA治疗中被救治的基因中富集（图2C）。接下来，作者发现Podo、DLH和PT对氧化应激的反应模块得分较高，而Neutro和Mφ对炎症的反应模块得分较高，这可以通过在DKD组中参与这两个过程的最可变基因的表达模式来展示（图2D和E）。

RA治疗缓解了由DN引起的PT S1细胞损伤

近曲小管（PT）是肾实质细胞的主要组成部分，密集包含线粒体并依赖氧化磷酸化作用，容易受到氧化、缺氧和代谢应激的损伤，从而促进糖尿病肾病的进展。为了研究PT在DKD组中的潜在机制，作者对PT相关的差异表达基因进行富集分析，发现这些基因主要富集在代谢过程和氧化应激相关的通路中，如小分子降解过程、尿酸代谢过程、活性氧代谢过程、氧化磷酸化和细胞对缺氧的反应（图3A）。具体而言，作者重新对PT细胞进行了12个聚类，根据经典标记物确定了它们的身份，并获得了三个亚型（即S1、S2和S3），每个亚型都具有特定的表达模式（图3B和C）。S1和S3段的特征是它们相应标记物的表达，而S2的标记基因（Fxyd2、Mif和Gsta2）也在其他段中表达，代表了PT的过渡状态（图3D）。此外，与正常小鼠相比，DKD组的S2段组成增加，经过RA治疗后，这种增加部分逆转。在S1中观察到相反的趋势（图3E）。

RA治疗改善DN小鼠的足细胞损伤

为了研究RA治疗对其他上皮细胞段的影响，作者将这些肾单位细胞重新聚类为9个亚型，使用了特定于聚类的标记基因，包括DLH、DCT1、DCT2、ALH、CD-PC、A-IC、B-IC、CD-Trans和Podo（图4A和B）。在DKD组中，ALH、B-IC和Podo的比例降低，而DCT2、A-IC和CD-PC亚型的比例明显增加。与DKD相比，RA治疗略微逆转了这些细胞段的比例变化（图4C，支持信息图S4A）。

RA治疗缓解炎症并减少S100a4巨噬细胞的招募

巨噬细胞表现出显著的可塑性，使它们能够根据局部微环境的信号调整其功能，并在炎症信号或抗原处理的刺激下招募额外的巨噬细胞。在这部分中，作者重新对数据集中的巨噬细胞进行了聚类，并确定了四个亚型（Gpx3+Mφ、Cd86+Mφ、S100a4+Mφ和Cd163+Mφ），每个亚型都具有独特的表达模式（图5A和支持信息图S5A）。通过亚型特异性的Cd86，Cd86+Mφ被确定为M1型巨噬细胞表型，而具有M2型表型的Cd163+Mφ显示出高水平的抗炎标志物表达，如Cd163、Clec10a和Cd209g。与缺氧诱导以及与炎症相关的基因（S100a4、Anxa2和Il1b）在S100a4+Mφ中富集（图5B）。最后，与白细胞迁移相关的过程和内吞作用在Cd86+Mφ、S100a4+Mφ和Cd163+Mφ中富集。值得注意的是，抗原处理和呈递过程特异性地出现在Cd86+Mφ中（图S5B）。然后，作者计算了每个亚型的细胞组成的变化，并发现与正常组相比，CD86+Mφ和S100a4+Mφ的比例在DKD组中分别减少和增加，而在RA治疗后这两种趋势都发生了逆转（图S5C）。

RA治疗改善DN小鼠的免疫功能障碍

淋巴细胞T、B细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）在先天免疫和适应性免疫中起着关键作用。作者重新对作者的数据集中的免疫细胞进行了聚类，并基于经典标记物（T细胞：Cd3d和Il7r；B细胞：Cd79b；NK细胞：Ncr1和Nkg7）和聚类特异基因（图6A和B）获得了八个亚型（即T_C1、T_C2、T_C3、T_C4、B_C1、B_C2、B_C3和NK）。其中，T_C1、T_C2和T_C3表现出CD8标记，表达了Cd8b1。有趣的是，T_C1和T_C2在DKD中的百分比增加，而在DKD_RA组中减少。相反，T_C3呈相反的趋势（图6C）。此外，作者观察到DKD小鼠的B_C1和NK细胞比例发生了明显变化，而RA治疗后这些变化被逆转，而其他亚型的变化较小（图6C）。此外，所有亚型中NK细胞显示出最高的细胞毒性和炎症模块得分（图6D和E；支持信息图S6A和S6B）。与DKD_RA组相比，RA治疗有效改善了DKD中NK细胞的细胞毒性和炎症反应（图6F）并减少了NK细胞中与炎症相关的基因表达，包括Cd48、Cd69、Cxcr6、Ccl5等（图S6C和S6D）。先前的研究已经报道了Cd48和Cd69在DN中的作用。接下来，作者观察到，在RA治疗后，NK细胞中上调的基因富集在细胞因子介导的信号通路和免疫应答的正调控中。相反，下调的基因富集在凋亡过程、T细胞增殖的负调控和细胞黏附的调控中（图6G）。

RA介导的小鼠DN肾间细胞交流

为了研究RA治疗对小鼠肾脏DN细胞间相互作用的影响，作者使用潜在的配体-受体（LR）对 26 46 评估了各种细胞类型和亚型之间的细胞通讯。作者发现在正常组、DKD组和DKD_RA组中，细胞类型之间存在广泛的交流（支持信息图S7A）。值得注意的是，肾上皮亚型（如PT S1、Podo和CD-PC）和免疫细胞（如Cd86+Mφ、S100a4+Mφ和NK）在DKD队列中的交流强度增加，而RA治疗后交流强度减弱。为了详细探索关键细胞类型的细胞通讯，作者检查了来自M1型巨噬细胞Cd86+Mφ、S100a4+Mφ、NK、PT S1和Podo的信号。有趣的是，与正常队列相比，DKD组中S100a4+Mφ与CP-PC、Neutro、NK、T_C2和TC_3之间的信号增加（图7A）。与此结果一致，Cd86+Mφ与T_C2、T_C3、NK和Neutro之间的细胞间交流增强（图S7B）。此外，DN微环境增加了NK细胞与炎症细胞亚型中的中性粒细胞、Cd86+Mφ和S100a4+Mφ之间的细胞间通讯（图7B），表明DN导致的细胞间相互作用紊乱主要涉及M1型巨噬细胞、NK细胞、中性粒细胞和T细胞亚型。如图7A和B所示；图S7B，RA治疗可以减少细胞间相互作用并重塑细胞间微环境。另一方面，作者观察到PT S1的损伤和炎症评分高于PT的其他部分（图S3B和S3C）。而DN增强了PT S1与M1型巨噬细胞和NK细胞的相互作用（图S7C）。然而，与其余细胞类型的相互作用没有显著变化（图S7D）。

总结

作者采用单细胞测序技术对DKD模型和RA治疗的转录组变化进行了分析。作者的结果表明，RA可以改善肾小管上皮损伤，特别是PT S1和被称为足细胞的肾小球上皮细胞，并减少由DN引起的氧化应激和炎症。此外，RA减少了与促炎信号相关的S100a4巨噬细胞的招募，并在DN期间重塑了免疫微环境。总的来说，该研究强调了RA在治疗DN中的重要性，并提出了潜在的新型DN诊断生物标志物。