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结果： 单细胞转录组学分析确定了不同的免疫细胞类型及其随年龄变化的分布情况scRNA-seq在4个不同时期的19只小鼠肝脏上进行，即5只新生儿和5只哺乳期（出生后第7天），3只幼年期（10周）和6只老年期（18个月）的小鼠（图1A）。经过定性过滤，获得了112,414个细胞用于进一步分析，并为了关注免疫微环境，作者进一步选择了89,542个Ptprc（Cd45）表达的免疫细胞。基于标记基因表达，通过t-分布随机邻域嵌入可视化，确定了9种细胞类型：周期细胞、T/自然杀伤T（NKT）细胞、自然杀伤（NK）细胞、单核细胞/巨噬细胞（mono/mac）、浆细胞样树突状细胞、传统树突状细胞（cDCs）、中性粒细胞、B细胞和浆细胞（图1B-C和补充图S1A，http://links./HEP/H971，补充表S1，http://links./HEP/H972）。值得注意的是，细胞按细胞身份聚类，而不是实验批次，表明年龄对转录组的影响（图1B）。这4组肝内免疫簇的分布显示，新生小鼠和哺乳小鼠中的细胞周期和中性粒细胞的百分比较高，而T/NKT细胞富集在年轻和老年小鼠中（图1D）。此外，仅在年轻小鼠的肝脏中观察到单核/巨噬细胞的减少，伴随着浆细胞样树突状细胞的富集，而B细胞在哺乳期唯一减少（图1D）。与Tabula Muris Consortium发表的研究一致，作者的结果显示，在免疫细胞类型的变化中，年轻和老年阶段单核/巨噬细胞的比例变化最显著（图1D和补充图S1B-C，http://links./HEP/H971）。这一发现进一步支持了作者数据的准确性，并增强了作者后续分析的可信度。
接下来，作者尝试对肝脏衰老过程中的免疫亚群进行分类。T细胞、NK细胞和NKT细胞都是淋巴细胞，它们的标记基因表达相似。因此，作者对T/NKT细胞和NK细胞进行了无监督聚类。根据典型标记基因的表达，总共出现了10个亚群，分别是：幼稚CD4 + T细胞、幼稚CD8 + T细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T细胞、T辅助17细胞、NKT细胞、γδ T细胞、常规NK细胞、肝脏驻留NK细胞和其他T细胞（图 (图2A2A和补充图S2A，http://links./HEP/H971）。在新生和哺乳期小鼠的肝脏中，肝脏驻留NK细胞的比例较高。幼年组中以幼稚CD4 + T细胞为主。在所有T/NKT/NK亚群的变化中，幼年和老年肝脏中细胞毒性T淋巴细胞的比例变化最显著，表明老年人中细胞内感染（如病毒感染和恶性细胞）更为频繁（图 (图2B)）。对于T/NKT/NK细胞，在新生和哺乳小鼠的肝脏中有显著更多的差异表达基因（DEGs），它们有很大的重叠（补充图S2B，http://links./HEP/H971和补充表S2，http://links./HEP/H973）。此外，功能富集分析显示，新生和哺乳小鼠肝脏中上调的基因富集于染色体组织和细胞周期相关的基因（补充图S2C，http://links./HEP/H971），包括Stfa1和Mki67（补充图S2D，http://links./HEP/H971）。相反，老年肝脏中的细胞群高度表达Nr4a2、Nr4a3、Tnfaip3和Gzmk（补充图S2D，http://links./HEP/H971），这些基因与白细胞相关的信号通路有关（补充图S2C，http://links./HEP/H971）。
作者的目标是从肝内免疫细胞的角度解决衰老过程。在确认衰老不会改变主要细胞类型已知的特征标记（补充图S7A，http://links./HEP/H971）后，作者确定了在衰老阶段表达差异的基因。根据Aging Atlas数据库， 22 与衰老相关的基因主要在单核/巨噬细胞中表达（图3A，补充表S3，http://links./HEP/H974）。值得注意的是，单核/巨噬细胞中SASP相关和细胞衰老相关基因的最高表达观察到在Cxcl2 + 巨噬细胞中（图3B），这表明这种细胞类型在肝脏稳态和衰老中起着重要作用。SASP表现为大量促炎细胞因子的增加分泌，并促进与衰老相关的炎症。因此，作者推测Cxcl2 + 巨噬细胞在诱导肝脏衰老的慢性炎症中发挥作用。比较功能富集分析显示，与身份相关的差异表达基因（DEGs）中，与免疫系统过程和细胞死亡相关的基因在所有4个单核/巨噬细胞亚型中都富集；然而，与白细胞迁移、激活和炎症反应相关的基因主要富集在Cxcl2 + 巨噬细胞中（图 （图33C）。
Cxcl2 + 促使巨噬细胞招募中性粒细胞到老化的肝脏中改变的细胞间通讯是衰老的一个综合特征。为了研究不同年龄段肝脏内细胞间的通讯，作者计算了年轻和老年肝脏中免疫细胞之间分泌的配体-受体对的数量和强度。结果显示，年轻肝脏中的免疫亚群显示出比老年肝脏中的亚群更少且更弱的相互作用（附图S9A，http://links./HEP/H971）。此外，分泌信号通路在这两组细胞之间的贡献不均，其中年轻小鼠中包括IL-10和PROS，而老年小鼠中包括CXCL、ANNEXIN、BMP、GDF、BAFF、OSM、CSF和SPP1（附图S9B，http://links./HEP/H971），表明年轻和老年小鼠之间的细胞间通讯存在显著差异。
Cxcl2 + 巨噬细胞刺激老年肝脏中的NET形成Cxcl2 + 产生的巨噬细胞产生最强的中性粒细胞信号表明，除了影响中性粒细胞的招募外，Cxcl2 + 巨噬细胞还可以改变中性粒细胞的表型。为了证明作者的假设，作者使用NicheNet预测可能驱动衰老过程中基因表达变化的配体-受体相互作用。作者获得了Cxcl2 + 巨噬细胞中前20个预测的配体及其在中性粒细胞中的受体（图 (图5A5A和补充图S10A，http://links./HEP/H971）。其中，Cxcl2和老年肝脏巨噬细胞中排名前3的配体被验证为具有最高的表达；这3个配体包括Ccl3，编码中性粒细胞招募过程中涉及的细胞因子CCL3；28 Tnf，编码中性粒细胞细胞毒性诱导剂TNF-α；29 和Il1b，编码重要的中性粒细胞活化剂IL-1β 30 （补充图S10B，http://links./HEP/H971）。CCL3可以通过与CCR1相互作用诱导局部中性粒细胞趋化；同时，已经证明TNF-α和IL-1β在引发NET形成方面起作用，表明肝内Cxcl2巨噬细胞可能通过CCL3-CCR1配体-受体对以及CXCL2-CXCR2轴吸引中性粒细胞，并随后通过促炎细胞因子TNF-α和IL-1β刺激中性粒细胞。大多数配体在老年肝脏的单/巨噬细胞中与其他免疫细胞类型相比表达显著（附加图S10C，http://links./HEP/H971）。
肝缺血再灌注损伤的体内模型揭示了Cxcl2 + 巨噬细胞加重了病理损伤接下来，作者使用了肝缺血再灌注损伤（HIRI）模型来进一步研究老年肝脏中巨噬细胞的功能。先前的研究表明，老年肝脏对外界压力的应对能力受损，导致HIRI期间出现与年龄相关的损伤。因此，作者通过90分钟的缺血和24小时的再灌注建立了HIRI模型。首先使用磷酸氯酮脂质体来清除肝内巨噬细胞，然后将从年轻或老年小鼠中分离出的肝内巨噬细胞移植到清除巨噬细胞的老年或年轻小鼠中（图6A和补充图S12A，http://links./HEP/H971）。为了追踪和评估移植的巨噬细胞的存活情况，作者首先使用1,1'-二十二碳烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚三氰化碘标记巨噬细胞，通过体内成像追踪它们，并发现移植的巨噬细胞主要积聚在脾脏和肝脏中（补充图S12B，http://links./HEP/H971）。作者进一步使用流式细胞术分析发现，在年老和年轻的受体小鼠的肝脏中，大部分肝内巨噬细胞由转移的巨噬细胞组成（补充图S12C，http://links./HEP/H971）。此外，TUNEL染色的结果显示，从年老和年轻小鼠中分离的巨噬细胞的存活率没有显著差异，因为两组转移的巨噬细胞都没有明显的凋亡迹象（补充图S12D，http://links./HEP/H971）。总体而言，这种方法产生了两个嵌合动物组，即年轻小鼠含有年老巨噬细胞（A→Y）和年老小鼠含有年轻巨噬细胞（Y→A），以进行进一步的实验。
CXCL2 + 通过驱动 CXCR2 + 中性粒细胞浸润与人体 OLT 后的肝损伤呈正相关 上述分析共同显示，老年小鼠肝脏内Cxcl2 + 巨噬细胞可以通过招募中性粒细胞加重肝损伤。然而，这是否适用于人类患者尚不清楚。为了调查这个问题，我们招募了40名因心脏死亡而死亡的患者，并从器官移植前（冷藏2-10小时后）和器官移植后（再灌注后2小时）收集了配对标本，并根据供体年龄分组，即年轻组（<30岁）和老年组（>55岁）。 总结 这项深入研究阐明了Cxcl2机制与巨噬细胞驱动的中性粒细胞激活有关，涉及CXCL2-CXCR2轴，并为年龄相关性肝损伤提供了潜在的治疗策略。
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