技术原理分析病原靶向测序(Targeted Next-generation Sequencing,tNGS)技术是一种基于超多重PCR扩增(或靶向捕获)与高通量测序两种技术的结合的新一代测序技术。它不依赖于传统的微生物培养,直接对临床样本中的几十种至几百种已知病原微生物及其毒力和/或耐药基因进行富集,再进行高通量测序,然后与数据库进行比对分析,根据比对到的序列信息来判断样本包含的病原微生物种类。 tNGS技术能够快速、客观地检测临床样本中较多的病原微生物,为临床诊断提供依据。同时,它对低浓度的病原微生物的检测,特别是其毒力和/或耐药基因检测具有优势。tNGS技术还能实现DNA和RNA共检测,细分亚种或亚型病原,快速检测出临床标本中不同类型的病原微生物,是一个可应用于多场景的技术平台。 “技术路线”方向:tNGS通过设计特定基因序列的引物/探针,对待测样品的核酸进行超多重PCR扩增/探针捕获,获得目标核酸片段,再对目标核酸片段进行高通量测序,对所得序列进行生信分析,实现对待测样本中的核酸进行高灵敏及高分辨率的识别。技术路线分为多重引物扩增及探针捕获(如下图)。 “产品设计”方向:tNGS的产品设计有两个方向,一种是以症候群为核心进行靶向捕获测序,例如针对上呼吸道感染常见几十种病原、或针对中枢神经系统感染的上百种病原等。另一种思路则是对单一流行性病原体的靶向捕获,例如新型冠状病毒、诺如病毒靶向测序等,病原体载量低、变异快、传播途径广,可以通过tNGS技术进行分子分型、病原溯源及流行病学研究。 技术的优劣势tNGS 技术的优势主要包括以下几点: 1)高灵敏度和特异性:能够检测到微量的病原体。 2)广覆盖范围:可同时检测多种病原体。 3)快速检测:缩短诊断时间。 4)无需预设:无需事先知道可能的病原体。 5)可检测未知病原体:发现新的病原体。 然而,它也存在一些劣势: 1)成本较高:检测费用相对较高。 2)数据解读复杂:需要专业知识和经验。 3)可能出现假阳性或假阴性结果。 4)对样本质量要求高。 5)实验室建设和运营成本高。 在实际应用中,需要综合考虑 tNGS 技术的优劣势,以确保其合理、有效地应用,下图详细比较多种测序技术的优缺点。 技术的应用1)感染性疾病诊断:帮助检测和鉴定各种病原体,包括细菌、病毒、真菌等。 2)未知病原体筛查:在传统检测方法无法明确病原体时进行筛查。 3)医院感染防控:监测医院内的感染传播。 4)免疫缺陷患者的监测:及时发现潜在的感染。 5)暴发疫情的调查:快速确定病原体,指导防控措施。 6)微生物群落分析:研究微生物群落的构成和功能。 7)药物敏感性检测:评估病原体对药物的敏感性。 8)临床研究:为新药研发和疾病机制研究提供支持。 专家共识国内正式发布了首个有关tNGS的专家共识—《高通量测序技术在分枝杆菌病诊断中的应用专家共识》,针对分枝杆菌病诊断上的高通量靶向测序的适应证、适宜送检人群及时机、阳性阈值的设定原则及判断标准等方面提出了专业的看法与科学的建议,同时也为tNGS在分枝杆菌病以外的病原领域应用提供了重要的参考价值。 2023年8月,中国医学科学院北京协和医院检验科徐英春、上海交通大学附属瑞金医院呼吸与危重症医学科瞿介明为通信作者的《成人呼吸道感染病原诊断核酸检测技术临床应用专家共识(2023)》发布。 技术展望的突破点tNGS 技术展望的突破点可能包括以下几个方面: 检测成本降低:通过技术改进和规模效应,降低检测费用,使其更广泛应用。 提高检测速度:缩短检测时间,满足临床快速诊断的需求。 拓展检测范围:覆盖更多的病原体和基因变异。 增强准确性和特异性:减少假阳性和假阴性结果。 一体化解决方案:整合样本采集、运输、检测和分析等环节。 人工智能与大数据应用:辅助解读复杂的检测数据。 临床应用拓展:在肿瘤诊断、免疫监测等领域发挥更大作用。 便携式设备开发:便于现场检测和普及。 多组学整合:结合其他组学数据,提供更全面的信息。 标准化和规范化:建立统一的检测标准和质量控制体系。 |
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来自: 刘得光3p6n6zqq > 《tNGS》