卓超丨不同的tNGS产品涌入市场，mNGS该何去何从？

讲者丨卓超（广东医科大学附属第一医院）

整理丨崔志超（青岛市黄岛区中心医院）

审核丨孔晓明（溧阳市人民医院）

来源丨SIFIC 2023“全国感控与耐药感染”联合大会

随着tNGS技术的涌入，tNGS市场份额的占有越来越高，那么，tNGS和mNGS这两个技术，究竟谁在前谁在后？是如何互补的呢？广东医科大学附属第一医院卓超教授就tNGS和mNGS这两种核酸检测技术的特点、发展与应用以及二者如何互为补充，从而提高病原诊断的效率，进行了深入浅出的解读与展望。

一、核酸检测技术的应用

（一）PCR技术：快速、准确、价格便宜，但是仅覆盖少量病原。

（二）宏基因组测序（mNGS）技术：专家共识推荐应用于疑难重症、疑难感染、新发突发传染病等场景。特点是广覆盖、无偏倚，但费用高，周期长，无法实现患者病原体快速、大批量筛查且受宿主序列干扰大。

（三）tNGS技术：既克服了PCR只能用于单纯且明确的病原体检测，又去除了mNGS 中非靶向的或者是人源干扰序列的影响。特点如下：

1. 可检测70-700种病原体+耐药基因（KPC、NDM等耐药基因）+毒力基因
2. 可实现DNA和RNA共检。
3. 是唯一适用咽拭子样本的NGS检测技术，满足儿童和特殊患者需求。
4. 经济、快速。
5. 覆盖了临床98%以上的感染场景。

二、tNGS技术原理与特点

（一）原理

tNGS技术 “t”就是英文“target”（靶向）的意思，即针对目标病原微生物基因序列设计特异引物，采用超多重PCR建库，对目标序列进行靶向扩增富集。结合二代测序技术，进行靶向高通量测序（tNGS），同时检测DNA和RNA病原体，TAT＜24h（相较于mNGS，所需时间会有所减少）。

（二）tNGS技术的特点

1. tNGS灵敏度不受宿主影响，但是检测限受引物影响。
2. tNGS富集效率与引物二聚体有关，信号大小与病原载量正相关。

简言之，如图所示，tNGS技术通过建立的靶向抗原，排除了人源DNA的干扰。通过对目标区域（部分引物可靶向多拷贝区域）进行二轮扩增后测序，保证99%以上的非靶标区域不进行扩增，扩增的准确度较高。

三、tNGS技术优势

（一）从数据库分析：tNGS对胞内菌和真菌的检出敏感性高

1. 以肺泡灌洗液样本中非典型性病原体的检出为例。已经知道，社区获得性肺炎（CAP）中因肺炎支原体感染的病例是比较多的，但是临床上通过治疗效果印证出的鹦鹉热衣原体感染的情况却更多，这其实是和感染病学理论相悖。但是tNGS检测的数据给大家解开了迷惑。从tNGS检测的数据来看，对于非典型性病原体而言，肺炎支原体的比例是超过鹦鹉热衣原体的，这更符合一个常态 CAP 的病原学情况。
2. 从肺泡灌洗液中真菌检出的情况来看。抛开感染和定植，检出最多的是白色念珠菌也是符合临床的。检出率第二名的是卡氏肺孢子菌。第三和第四名分别是烟曲霉和新生隐球菌，这两种真菌的检出，在传统的二代测序里面，往往是个短板，因为它们的细胞壁比较厚，鉴于破壁技术的问题，有时候会出现假阴性的情况。马尔尼菲蓝状菌的检出，排在第五位，这是因为该数据来源于两广地区，而马尔尼菲蓝状菌主要在广东、广西较多，也往往是漏诊的一类真菌，所以从整个数据来看，是比较符合临床实际的。

（二）鉴定准确：tNGS范围内病原检出敏感性优于mNGS

检测一个标本，mNGS选择的通量一般是 20M。其中，包涵了大量的人源DNA，从而导致病原性DNA可能会出现一个阴性。而现在tNGS选择的通量一般是1M，降低成本的同时，病原性DNA的量却没有减少很多，所以，tNGS的性价比要高于传统的mNGS。

因此，当病原浓度＜10⁵时：扩增子序列＞＞探针捕获测序＞＞mNGS；当病原浓度＜10⁴时：扩增子序列敏感性是探针捕获测序的10～100倍。

（三）分型精确：tNGS分型定种能力更优越

鉴于分型过程中，RNA病毒不同亚种致病力、感染脏器不同、非结核分枝杆菌（NTM）不同亚种耐药性截然不同、多种链球菌生物近缘性高，mNGS难以区分。

而tNGS扩增子囊括鉴定分型的多态性位点，NGS直接读取，分型更精准。对鼻病毒、肠道病毒、腺病毒可精准分类到亚型、分枝杆菌、链球菌等定位到种和亚种。

众所周知，体内存在堪萨斯分枝杆菌、苏氏分枝杆菌、戈登分枝杆菌等致病菌感染，影响检查结果，发生T-SPOT假阳性。同时自身免疫系统疾病引起的机体免疫紊乱，导致T淋巴细胞中非特异性γ干扰素释放增多，干扰T-SPOT结果，出现T-SPOT假阳性。另外，重症脓毒症，或者胞内病毒严重感染时，T淋巴细胞处于高度活化状态，也会导致T淋巴细胞中非特异性γ干扰素释放增多，导致T-SPOT出现假阳性。而此时，如果有tNGS技术帮助临床医生去确定患者所感染的到底是哪种分枝杆菌，将会大大帮助临床医生更好的对症治疗。

（四）适用场景广泛，可应用于多场景的方法学平台。

四、mNGS技术优势与不足

（一）优势：①应用范围广，适用于所有系统的感染；②TAT短，极限20h可出结果；③无需假设，无需培养，可覆盖2万余种病原体；④检测的灵敏度较高，可检测样本中微量的病原体、耐药基因和毒力基因。

（二）劣势：①特殊病原体/标本的DNA/RNA技术要求不同；②受人源核酸影响或数据库收录不全，造成假阴性；③易引入环境或试剂种病原核酸污染，造成假阳性；④胞内病原体、分枝杆菌和真菌的检出敏感性较低；⑤受人源核酸影响耐药基因检出率低；⑥行业未形成标准化，临床解读难。

五、tNGS与mNGS的关系

tNGS是病原体靶向技术，集合了多重PCR +高通量的优势，针对靶标区域按需放大，不去重，实际序列多样性低。此外，tNGS对污染防控要求高，无菌体液尤其血液检测能力需要突破性。

mNGS 是无靶向性的，可针对罕见/特殊病原体的检测，但是有一定的局限性。结果判读越多就越需要有丰富的临床微生物知识、临床感染知识来去解读。另外，mNGS所获得的序列经过去重，每一条序列都是互不相同的，实际序列多样性高。

小 结

总之，tNGS和mNGS的序列数含义不同，不可跨技术对比，可技术内相对定量，二者应该互为补充，共同提高病原诊断的效率。