施毅丨靶向高通量测序（tNGS）技术——一款更接近临床微生物感染真相的病原测序产品

讲者丨施毅（南京大学医学院附属金陵医院）

整理丨韦婵（柳州市工人医院）

审核丨胡仁静（江南大学附属中心医院）

来源丨SIFIC 2023“全国感控与耐药感染”联合大会

明确导致感染的病原体是临床感染性疾病诊疗中的关键步骤。由于病原体种类繁多、感染的临床症候群表现各异、确诊手段数量有限等原因导致感染性疾病的诊断复杂程度高，也加大了感染性疾病的治疗难度。因此，临床需要一款高效、快速、准确的检测方法。在SIFIC 2023“全国感控与耐药感染”联合大会上来自南京大学医学院附属金陵医院的施毅老师对新型的检测方法——tNGS进行了详细介绍，tNGS有望解决目前的困境。

一、tNGS技术诞生之路

（一）地球是一个微生物的世界——病原体的储存库

目前已知有12万种微生物，其中2000余种对人类而言是病原体。人类活动和环境的变化，导致微生物进入人类社会，从而引起人类感染。

（二）感染性疾病实验室的工作

感染性实验室直接或间接证明了宿主组织、血液、体液或排泄物中病毒、细菌、真菌或寄生虫的存在，了解微生物对抗菌药物的敏感性、有无毒力因子等，从而帮助指导临床诊疗。由于病原体种类繁多、感染的脏器系统多、感染的临床症候群表现各异、确诊手段数量有限等多种原因导致感染性疾病的诊断难度高。对于人类而言，快速、精准地找到病原与耐药谱是未来的导向。

（三）感染性疾病现状——“五个挑战”

感染性疾病目前面临着五个挑战：①新现和再现的传染病；②非传染性感染疾病；③抗微生物药物耐药；④感染诊断技术的滞后；⑤检验结果分析专业人才的缺失。在此挑战下，传统的病原微生物检测手段如形态学、分离培养与鉴定、抗原抗体检测和分子生物学技术不能满足临床的需求。

（四）mNGS打开病原检测的潘多拉星球

mNGS通过检测所有生物遗传物质的总和，广覆盖、无偏倚、无需培养的对临床标本进行检测。mNGS在探索微生物未知领域，使得临床诊断由“预判-验证”直接跳跃至“无需预判”，将标本中所含有的所有微生物“一网打尽”，改变了临床感染的诊断模式。

1.目前mNGS应用于以下场景

（1）疑难危重感染

（2）新发罕见病原

（3）混合感染

（4）免疫缺陷患者感染

2.适用于以下情况

（1）呼吸道感染

（2）血流感染

（3）中枢神经系统感染

（4）局灶性感染

（五）mNGS的优势也是其临床应用的边界和局限

1. 广覆盖的检测导致其时效较长；
2. 对于调整抗微生物药物的指导目前也具有不确定性；
3. 各检测平台的检测差异、质量控制导致结果不一定具有一致性；
4. 报告多种微生物，如何确定责任病原体（定植污染感染）；
5. 真阴性率只有50%？排除感染能力能够满足临床需求吗？
6. 深部感染价值有限（肺、腹、心内膜炎等）。

二、tNGS检测技术的价值

（一）导致临床感染的病原种类是有限的

1.近10万例mNGS大数据及100万例非mNGS检测数据显示：

（1）不同标本类型病原谱不同

（2）核心病原只有50-100种

2.mNGS全方位的检测真的有必要吗？

（二）依托感染大数据，研发更适合临床需求的NGS产品

大数据显示：①不同脏器和系统感染的核心病原体不同；②同一病原体在不同脏器系统检出的意义不同；③聚焦核心病原体，不同部位检测不同病原谱，也许更接近临床感染微生物的真相。

（三）tNGS：靶向抗原，突破病原检测的局限性，保障耐药/毒力基因准确检出

基于mNGS大数据及非mNGS数据分析，靶向病原谱，对不同标本进行“精准捕捞”。

tNGS结合超多重PCR（正向富集）+高通量测序进行测序。靶向富集目标病原体核酸，特异性增加目标病原序列数和比例，提高目标微生物reads数和覆盖度，保障难检、苛养、低载量病原的检出，同时检测毒力基因（为区分致病菌和定植菌提供基础）与耐药基因（与致病病原/耐药表型结合）。

（四）解决多重PCR和mNGS痛点，青出于蓝而胜于蓝

1. 广谱：病原范围70～700种（不同症候群设置不同，可满足98%临床需求的panel）；
2. 超敏：比mNGS更敏感（最低检测限100copies/ml，无宿主序列影响）；
3. 高效：高性价比（mNGS 1/5～1/6，但可解决98%的临床问题）；
4. 精准：病原精准分型（还原病原真实含量，为定植或污染提供数据）；
5. DNA+RNA共检，无需分开送检。

三、以症候群为核心的产品矩阵

（一）多产品系列布局，满足不同临床需求

1. 上感50TM：针对上呼吸道感染常见96种病原，尤其适用儿童患者，关注DNA和RNA病毒，百日咳鲍特菌、肺炎链球菌、肺炎支原体等；
2. 呼吸100 TM：针对下呼吸道感染常见198种病原，特别是CAP，关注细菌、真菌、病毒、非典型病原体、分枝杆菌；
3. 神经100 TM：105种病原体导致中枢神经系统感染的病原；
4. 感染100 TM：443种病原体，针对99%临床感染场景，适用脓毒症，不明原因发热，弥漫性肺部病变等疑难、危重疾病；
5. TB-NTM：针对结核、非结核分枝杆菌感染，针对性破壁，极大的提高结核检出率，涵盖一线和二线药物耐药基因。

（二）tNGS技术在呼吸系统感染中的应用潜力

对于成人患者，tNGS在呼吸道病原微生物检测方面的效能与mNGS相当，且更具卫生经济学价值。

（三）tNGS技术在结核及结核耐药中的应用价值

与XPert敏感性相同，与mNGS效果相当。

（四）可用于开辟病理切片上诊断耐药结核病的新途径

（五）tNGS解读与mNGS类似

（六）不同产品适用场景

1. 常见病原检测手段/tNGS：基层群体/常见感染患者；
2. tNGS：各种系统社区获得性感染/医院获得性感染；
3. mNGS：不明原因、罕见、疑难、反复、慢性感染、排除感染、病原知识库的积累。

（七）其他公司产品

1. 病原微生物tNGS检测方案（先声诊断）：大呼吸、小呼吸、中枢、感染；
2. Dane-seq病原微生物多重靶向检测（迪安，采用三代测序）；
3. 脑脊液tNGS（迪飞）；
4. IDseqTM Ultra，探针捕获的tNGS（微远，精准，价格高，耗时长）。

小 结

施老师详细介绍了tNGS检测病原微生物的原理、优点、适用的临床场景、未来的应用前景，以及目前市场上常见的tNGS检测包。不同的检测方法有不同的优点，没有最佳的检测方法，适合的才是最好的！