【原】动物研究系统 | 第4期. Cell文章解析条件性基因敲除小鼠的应用

往期回顾：

今天我们将以一篇Cell文章为实例给大家解析条件性基因敲除小鼠的应用。该文章为了明确纤维化疤痕组织中的Col V（基因Col5a1）在损伤心脏中的功能，构建了Col5a1 flox小鼠，通过与成纤维细胞特异的诱导性Cre鼠Col1a2CreERT交配，实现在成纤维细胞中特异敲除Col5a1。

01

Col5a1 flox小鼠构建与繁育策略

Production of Col5a1 floxed mice

该文章中的Col5a1 flox小鼠构建策略见图1：

图1. Col5a1 flox小鼠构建示意图

是不是感觉有点复杂？接下来我们来分步详细介绍

1

首先将含有Col5a1基因的E3和E4外显子两侧的SpeI和SphI位点插入loxP序列和Neo序列，并在Neo两侧加入两个FRT位点和一个胸苷激酶(tk)阴性选择序列的载体

2

将载体线性化后转入胚胎干细胞中，与野生型（Wild-type Allele）同源重组，然后经G418抗性和ganciclovir双重筛选，将整合有同源重组基因的等位基因的杂合阳性胚胎干细胞注射到野生型小鼠囊胚中

3

将嵌合雄鼠与C57BL/6雌鼠交配，产生靶向（Col5a1^ta/wt）小鼠，将Col5a1^ta/wt小鼠与种系特异性Flp转基因小鼠杂交，去除Neo，产生杂合子Col5a1 flox（Col5a1^flox/wt）小鼠

4

参考我们先前推送的小鼠繁育策略（第2期. 条件性基因敲除小鼠系统的构建原理及应用），将Col5a1^flox/wt与Col5a1^flox/wt交配即可获得纯合Col5a1^flox/flox小鼠。将Col1a2CreERT小鼠与Col5a1 flox（Col5a1^flox/flox或Col5a1^flox/wt）鼠交配获得表达Col1a2CreERT的Col5a1 flox小鼠

5

给子代小鼠注射他莫昔芬（每日1毫克），缺血损伤前连续注射5天，损伤后持续注射7天他莫昔芬，实现成纤维细胞特异性敲除Col5a1（Col5a1 CKO），对照小鼠采用Col5a1^flox/flox鼠，并注射同样的剂量的他莫昔芬，进行后续Col V（基因Col5a1）在损伤心脏中的功能研究。

02

Col5a1 CKO小鼠的应用策略

Application of Col5a1 CKO mice

通过RNA-FISH验证Col5a1的敲除效率（图2A），并对Col5a1的敲除效率进行定量分析（图2B）。

图2. Col5a1的敲除效率验证

明确Col5a1的敲除效率后再进行相应的功能表型分析，如Col5a1敲除后对损伤小鼠心脏功能的影响（图3A-3B）和组织纤维化程度的影响（图3C-3F）。

图3. Col5a1敲除后的表型分析

值得注意的是，作者为了明确成纤维细胞特异性敲除Col5a1的作用，选择将Col5a1 flox小鼠与成纤维细胞特异表达的TCF21 Tcf21MCM小鼠进行交配，进行其表型的验证。这么做是由于Cre小鼠表达有其时空特异性，无法实现真正意义上的特异，通常会使用多个Cre鼠敲除进行同一表型的验证。

验证条件性小鼠的敲除效率除了RNA-FISH外，还可以采用免疫荧光染色或分离基因特定敲除的细胞类型进行qRT-PCR或western blot检测。

今天的分享就到这里了，希望通过今天的分享让大家对条件性基因敲除小鼠的构建和应用有了更为深入的了解，并能够根据cell文章的条件性基因敲除小鼠应用实例解析来设计自己的实验。

参考文献：

[1] Yokota T, McCourt J, Ma F, et al. Type V Collagen in Scar Tissue Regulates the Size of Scar after Heart Injury. Cell. 2020;182(3):545-562.e23. doi:10.1016/j.cell.2020.06.030

[2] Sun M, Chen S, Adams SM, et al. Collagen V is a dominant regulator of collagen fibrillogenesis: dysfunctional regulation of structure and function in a corneal-stroma-specific Col5a1-null mouse model. J Cell Sci. 2011;124(Pt 23):4096-4105. doi:10.1242/jcs.091363

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