|
于 我 们 创伤精准修复公众号是创伤精准修复课题组（W&H Group）的官方公众号。本课题组以创伤精准修复与临床转化为主要研究方向。 公众号推出的每一篇文章均是由W&H Group成员精选精读，旨在分享传播与创伤修复相关的最新科研成果。 知识点1 — TSrPs纳米颗粒的一步矿化法制备 将1、5和10 mg/mL的单宁酸（TA）溶解在离子饱和溶液中（1 M NaCl、200 mM SrCl2和10 mM Na2HPO4溶解在蒸馏水（DW）中，pH 4.35）。然后，将NaHCO3 （0.04 M）加入到溶液中，在700 rpm的磁力搅拌下开始矿化10分钟。通过离心（4000 rpm，10分钟）收集纳米颗粒，并在室温（RT）下在Tris–HCl缓冲液（pH 8.8）中再分散10分钟，以通过去质子化稳定颗粒。最后，用DW洗涤TSrPs，冻干后储存在干燥器中。 知识点2 — 角化过度对创面愈合的影响 在慢性伤口环境中，过度的炎症导致肿瘤坏死因子-α （TNF-α）等细胞因子的持续分泌，刺激角质形成细胞增殖，导致表皮增厚并伴有角化过度和角化不全。 知识点3 — 差异表达基因（DEGs）分析的软件、使用方法及数据库 使用Bowtie2将处理后的读数与智人进行比对。使用Subread中的“特征计数”总结基因计数矩阵。智人的参考基因组序列和注释数据（GRCh38.p14）是从NCBI数据库下载的。基于该结果，基因的表达丰度计算为每个样品的FPKM值（每百万个作图片段中外显子每千个碱基的片段数）。表达谱用于进行额外的分析，如DEGs。在具有不同条件的组中，差异表达的基因或转录物可以通过统计假设检验来筛选。热图使用Pheatmap生成。FPKM值用作构建热图的输入数据。使用Enhanced Volcano生成火山图，以可视化差异表达分析的结果。使用基于DEGs的ClusterProfiler进行GO/KEGG功能注释或富集分析。 在过度炎症的情况下，新生血管受损对伤口愈合形成了重大挑战。在这里，汉阳大学生物工程系Heungsoo Shin教授提出了一种多功能复合水凝胶，通过对水凝胶的适应性降解来募集和激活巨噬细胞，从而克服了这些条件。这种复合水凝胶（G-TSrP）是由明胶甲基丙烯酰（GelMA）和由单宁酸（TA）和Sr2+组成的纳米颗粒（TSrP）结合而成的。这些纳米颗粒的制备采用一步矿化法形成金属酚网络。G-TSrP可以消除活性氧并且诱导巨噬细胞向M2表型极化。研究发现，G-TSrP中TA和Sr2+的释放积极促进巨噬细胞细胞外基质重塑基因的募集和表达上调，从而协调G-TSrP在体内的适应性降解。最重要的是，尽管TA具有抑制血管生成的作用，其抑制作用被释放的Sr2+所抵消，因此G-TSrP可以加速血管生成。此外，G-TSrP促进炎症条件下的伤口愈合，促进正常组织形成，加速血管生长。遗传分析结果证实巨噬细胞介导的复合水凝胶促进伤口愈合。总的来说，这些发现为通过创造再生环境来促进伤口愈合的生物材料的发展奠定了基础。   通过将单宁酸（TA）与离子饱和溶液混合一步法制备TSrPs。然后通过物理相互作用将纳米颗粒掺入GelMA水凝胶中。在炎症伤口中，G-TSrP释放TA和Sr2+以募集和极化巨噬细胞进入M2状态，从而加速再生途径。此外，胶原合成和基质金属蛋白酶（MMP）分泌增加以及内皮细胞成熟分别对细胞外基质（ECM）重塑和血管生成至关重要，极化的M2巨噬细胞与Sr2+共同刺激成纤维细胞和内皮细胞。  （a、b）TSrP的扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）图像和尺寸分布。用浓度分别为1、5和10 mg/mL的TA制备的纳米颗粒具有平均直径为548、308和213 nm的凹凸不平的球形结构。 （c）纳米颗粒的傅里叶变换红外光谱。随着TA浓度的增加，Sr2+和PO43-之间的键合相对受到抑制，表明带负电荷的PO43-与TA竞争结合。（d） TSrP的能量分散X射线（EDX）元素绘图和分析。TSrP中锶和磷的质量百分比持续降低。（e） TSrPs的总酚含量的Folin-Ciocalteu分析结果。证实总酚含量的增加与TA浓度成比例。（f） TSrP的ABTS自由基清除作用。TA通过电子转移的自由基清除作用在TSrPs中得以保持，并随着纳米颗粒浓度的增加而成比例地增加。  （a）具有不同浓度TSrP的水凝胶的光学图像。制备水凝胶为棕绿色调，并且随着TSrP浓度的增加而变暗。（b）冻干后水凝胶横截面的SEM图像。图像证实了包埋纳米颗粒的存在。（c、d）具有不同浓度TSrP的水凝胶的溶胀比及其储能模量。TA沉积导致的更大亲水性，通过水扩散到聚合物网络中导致溶胀率的增加，由于TSrPs对自由基的清除，储能模量降低。有效的抗氧化剂可以清除活性氧，这是甲基丙烯酸酯基团之间形成共价键所必需的。（e、f）从拉伸试验获得的杨氏模量和具有相同储能模量的GelMA和G-TSrP水凝胶的邻苯二甲醛测定结果。TSrP的掺入产生了具有更大柔韧性和韧性的水凝胶。OPA分析显示，G-TSrP中的游离伯胺基团显著减少，这表明来自富含赖氨酸的明胶的伯胺很可能与TSrP表面的羟基形成了氢键。（g）具有不同TSrP浓度的水凝胶的ABTS自由基清除效果。由于TSrP的存在，G-TSrP还表现出剂量依赖性的ROS清除特性。（h、i）人皮肤成纤维细胞（HDFBs）的代表性活/死染色图像和各种细胞类型的活力。当细胞与水凝胶提取物一起培养时，几乎没有发现G-TSrP对各种细胞类型（包括成纤维细胞、角质细胞和内皮细胞）的细胞毒性。  （a）用LPS和水凝胶提取物处理后RAW264.7细胞的免疫荧光（IF）图像中iNOS阳性细胞的百分比。接受LPS处理的巨噬细胞与可诱导的iNOS阳性M1巨噬细胞群体的显著激增相关，在G-TSrP提取物存在下，其水平显著降低。（b）用LPS和水凝胶提取物处理后的RAW264.7细胞的F-肌动蛋白染色图像，以及对其细胞面积的测量。在LPS处理组中细胞大小显著增加，而用G-TSrP提取物培养的细胞仅表现出最小的变化。（c）白细胞介素（IL）-4和水凝胶提取物处理后RAW264.7细胞的IF图像中CD206阳性细胞的百分比。在G-TSrP提取物存在下M2标记蛋白CD206的表达显著增加。（d）用IL-4和水凝胶提取物处理后的RAW264.7细胞的F-肌动蛋白染色图像，以及它们长宽比的测量。在G-TSrP提取物存在下，长宽比持续增加，表明巨噬细胞的M2极化。（e、f）使用水凝胶提取物培养的RAW264.7细胞的（e）M1标记和（f）M2标记的相对基因表达及其诱导因子（M1：脂多糖，M2：白介素-4）。在G-TSrP组中，M1极化标记（TNF-α、iNOS和IL-1β）的基因表达减少，而M2极化标记（CD163和CD206）增加，这进一步支持了提取物增加巨噬细胞由M1向M2极化程度的影响。  （a）建立炎症伤口愈合模型和时间表的示意图。在将水凝胶植入伤口部位后，每3天用LPS治疗小鼠。（b、c）植入不同水凝胶后伤口区域的代表性图像、示意图和闭合伤口的量化。在植入6天后用G-TSrP治疗的组中伤口闭合过程的显著加速。（d-f）代表性的H&E染色图像和第21天伤口组织的伤口长度和肉芽厚度的分析。G-TSrP组的伤口长度明显更短，肉芽组织的厚度明显更大。使用G-TSrP快速修复开放性伤口可能是通过与宿主的免疫反应积极互动来促进组织再生而实现的。促进细胞渗透和协同水凝胶降解不仅会加速伤口闭合，还会刺激治疗分子（Sr2+和TA）的分泌，诱导肉芽组织的形成。（g-i）植入后21天伤口中细胞角蛋白的代表性IF染色图像及其放大图像；染色图像分析毛囊数量和表皮厚度。G-TSrP组的圆形毛囊数量明显更多，在G-TSrP组中，极化的M2巨噬细胞可能被诱导通过Wnt信号触发毛囊新生，以响应成纤维细胞生长因子-2和胰岛素样生长因子-1等生长因子，释放的Sr2+和TA促进了这些生长因子。此外，作者发现与使用G-TSrP相关的表皮厚度与正常组织相似，潜在地证明了调制性角化过度。在慢性伤口环境中，过度炎症导致肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子持续分泌，刺激角质细胞增殖，导致表皮增厚伴角化过度和角化不全，G-TSrP似乎可以调节炎症，从而控制角质细胞的过度增殖。  （a）在LPS存在下,不同水凝胶提取物处理后RAW264.7细胞的总基因表达热图数据。（b）代表与GelMA组相比G-TSP组中基因表达的火山图。表明与GelMA相比G-TSP组DEGs中517个基因显著上调，245个基因下调。与TA相比，G-TSrP组在DEGs有826个基因上调，163个基因下调。（c）显示GelMA、TA和G-TSrP组巨噬细胞中基因差异的主成分分析（PCA）图。G-TSrP组与GelMA和TA组明显不同，强调了与不同治疗相关的不同分子特征，并强调了G-TSrP在炎症伤口愈合过程中对巨噬细胞行为的潜在影响。（d）上调和下调基因本体分析。G-TSrP提取物通过M2极化增强了炎症条件下巨噬细胞的运动能力并促进了VEGF的产生。然而，它也下调了与促炎症和细胞迁移抑制相关的基因表达。（e）G-TSrP促进巨噬细胞介导的伤口愈合过程的机制示意图。TSrP通过细胞迁移、免疫调节、基质重塑和促进血管生成而有助于炎症性伤口愈合。植入G-TSrP后，TA和Sr2+的释放刺激巨噬细胞向植入区域迁移。然后巨噬细胞极化成M2巨噬细胞，随后渗入水凝胶。随着水凝胶逐渐降解，大量M2巨噬细胞与G-TSrP中残留的TA和Sr2+协同作用，积极参与ECM重塑并促进血管生成。（f）免疫反应的正向调节GO富集分析。在G-TSrP组中观察到与免疫反应的正调节相关的GO:0050778的显著下调模式，这支持了巨噬细胞的伤口愈合机制，表明G-TSrP具有免疫调节作用。（g）细胞迁移GO富集分析。在GO:0016477类别中基因表达的相关变化很明显。这些募集的巨噬细胞通过吞噬作用和MMP分泌促进水凝胶降解。（h）血管生成GO富集分析。水凝胶降解后，M2极化的巨噬细胞促进了血管生成，形成血管化组织。G-TSrP组中与血管生成相关的基因表达上调明显。 本研究设计了一种多功能纳米复合水凝胶，旨在增强巨噬细胞的募集和极化，最终促进炎症皮肤伤口中血管生成。水凝胶中的纳米颗粒是使用一步矿化技术制造的，该技术利用TA和Sr2+形成金属-酚网络。这些纳米颗粒可以通过物理相互作用无缝整合到GelMA水凝胶中，保留其清除ROS的独特能力。纳米复合水凝胶的提取物不仅有效地清除细胞内ROS，而且促进巨噬细胞M2极化，同时下调M1极化。此外，G-TSrP水凝胶的提取物表现出促血管生成的潜力，抵消了TA的抗血管生成特性。G-TSrP通过巨噬细胞的化学吸引和M2极化显著增强各种细胞类型，特别是巨噬细胞和内皮细胞的募集。它还通过促进细胞介导的生物降解微环境来帮助增强水凝胶降解。在炎症伤口愈合的体内模型中，作者观察到当使用G-TSrP时伤口愈合加速，再生的皮肤组织与正常组织相似。对用LPS和水凝胶提取物处理的巨噬细胞的基因分析阐明了炎症性伤口愈合背后的机制，强调了复合水凝胶在巨噬细胞归巢和根据伤口愈合主动调节其功能中的关键作用。 |
|
|
来自： 付刚8bid499jz5 > 《科研》
