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题目：Jasmonate mimic modulates cell elongation by regulating antagonistic bHLH transcription factors via brassinosteroid signaling 刊名：Plant Physiology 作者：Yuyi Zhou, Liusheng Duan et al. 单位：China Agricultural University 日期：18 April 2024    01 摘要  倒伏限制了玉米的生长、发育和产量形成。较短的节间长度有利于抗倒伏。然而，尽管已知油菜素甾体（BR）和茉莉酸（JA）能拮抗调节节间生长，但其潜在的分子机制尚不清楚。在本研究中，应用JA模拟冠状病毒（COR）抑制了拔节期的基本节间伸长，并抑制了细胞壁相关基因XYLOGLUCAN内转葡糖基酶/水解酶1（ZmXTH1）的表达，该基因在玉米植株中的过表达促进了节间伸长。我们证明了碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子ZmbHLH154直接与ZmXTH1启动子结合并诱导其表达，而bHLH转录因子ILI1结合bHLH 1（ZmIBH1）通过与ZmbHLH1 54形成异二聚体来抑制这种转录激活。过表达ZmbHLH154导致较长的节间，而ZmbHLH154突变体比野生型具有更短的节间。核心JA依赖性转录因子ZmMYC2-4和ZmMYC2-6与BR信号传导的关键因子BRASSINAZOLE RESISTANT 1（ZmBZR1）相互作用，这些相互作用消除了ZmBZR1对其下游基因ZmIBH1的抑制作用。总之，这些结果揭示了一个信号模块，其中JA通过减弱BR信号来调节bHLH网络，从而抑制ZmXTH1的表达，从而调节玉米中的细胞伸长。 02 技术路线  overexpression transgenic plants used in this study were generated Exogenous COR treatment Phenotypic determination of agronomic traits RNA Extraction and RT-qPCR analysis Histochemical analysis of vascular structure Western blot EMSA、LUC、transcriptome analysis 03 主要结果 3.1 COR处理通过抑制细胞伸长缩短玉米节间长度 为了探索COR如何缩短玉米节间，我们在V8（八片展开叶）阶段将30μM COR喷洒在自交系B73的叶面上。在灌浆阶段，观察到用COR处理的植物明显短于对照（图1A，B）。事实上，与对照相比，COR处理植物的株高和穗高分别下降了8.4%和23.7%（图1B，C）。与对照相比，COR处理植物的基部节间（节间7-9）在V13阶段显著缩短（图1D）。 为了研究缩短的原因，我们解剖了第8节间的内部结构，它表现出明显的缩短（图1E）。纵向切片的显微镜观察显示，COR处理和未处理的植物之间的薄壁细胞存在差异（图1F）。COR处理的植物第8节间的薄壁细胞比对照的短（图1G）。这些结果表明，COR可能归因于对玉米细胞伸长的抑制
3.2 ZmXTH1在不影响穗粒大小的情况下促进细胞伸长并正向调节节间伸长 为了深入了解COR抑制基础节间伸长的机制，我们使用先前的转录组数据分析发现，COR喷雾处理显著下调了细胞壁相关基因的表达，其中ZmXTH1的表达水平被高度抑制。 为了证实COR对ZmXTH1表达的影响，我们进行了逆转录定量PCR（RT-qPCR），以监测其在V8阶段30µM COR处理的玉米自交系B73中表达的变化。在所检查的所有时间点，COR处理显著抑制ZmXTH1的表达。与对照组相比，ZmXTH1的表达在6小时和24小时分别下降了1.8倍和3.1倍（图2A）。 我们还测量了10个玉米品种在30μM COR处理24小时时ZmXTH1的表达。ZmXTH1在10个品种的节间伸长区的表达水平显著低于对照（图2B）。这些结果表明ZmXTH1表达水平的降低可能与节间长度的变化一致。我们使用水稻和拟南芥中ZmXTH1及其同源蛋白的全长蛋白序列重建了系统发育树（图2C）。ZmXTH1在进化树上与OsXTH19、OsXTH20、OsXTH24、OsXTH2 8和AtXTH33接近；这些蛋白质与细胞延伸或细胞扩增相关。RT-qPCR分析显示，ZmXTH1在伸长的节间中特别高表达，在幼穗、成叶、流苏和花丝中低表达甚至不表达（图2D）。这些结果表明ZmXTH1转录水平与节间伸长有关。
图2 COR抑制ZmXTH1在伸长节间的表达。 A、 30μM COR处理后0、6、24、48小时，自交系B73节间伸长区ZmXTH1的相对表达水平。 B、 用30μM COR.C处理10个玉米品种24小时后，ZmXTH1在节间伸长区的转录表达水平 C ZmXTH1及其同源蛋白的系统发育树，与水稻（Oryza sativa L.）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）的细胞伸长和扩增有关。 D、 ZmXTH1在植物发育过程中不同组织中的相对表达水平。 为了确定ZmXTH1是否与节间伸长有关，我们使用ND101作为受体材料来产生转基因玉米植物，其过表达由玉米泛素启动子驱动的ZmXTH1[补充图S2]。与ND101相比，两个独立的ZmXTH1过表达系（ZmXTH1-OE#1和OE#2）的株高和穗高显著增加（图3A-C）。ZmXTH1过表达植物的基部节间明显长于ND101，但较薄（图3D）。此外，与ND101相比，ZmXTH1过表达植物的第8节间的纤维素、半纤维素和木质素含量显著降低。ZmXTH1过表达植物和ND101之间的果穗和果核大小没有差异。ZmXTH1的差异表达对每穗产量没有明显影响。对第8节间纵向切片的组织学观察显示，与ND101相比，ZmXTH1过表达植物的薄壁细胞更长（图3E，F）。这些结果表明，ZmXTH1过表达植物的伸长表型主要归因于节间细胞伸长的增加。 通过观察中胚轴的生长，ND101在1μM COR处理后使中胚轴长度缩短了22.1%，而ZmXTH1过表达幼苗的中胚轴分别缩短了14.5%和15.3%。这些结果表明，ZmXTH1过表达系对COR的敏感性低于ND101。因此，ZmXTH1通过正向调节细胞伸长来控制节间长度。
3.3 ZmXTH1被ZmbHLH154正向调节 为了研究调节ZmXTH1的机制，我们将ZmXTH1-转录起始位点上游约2kb的启动子序列分为三个片段，并通过酵母单杂交（Y1H）筛选筛选ZmbHLH154与第一个片段相互作用（图4A，B）。系统发育分析表明，ZmbHLH154与拟南芥ACE同源。亚细胞定位发现ZmbHLH154绿色荧光蛋白（GFP）信号与细胞核标记p2300-35S-H2B-mCherry信号很好地融合，表明ZmbHLH1 54定位在细胞核中。此外，ZmbHLH154具有与ZmXTH1相似的组织特异性表达模式。典型的bHLH转录因子通过与启动子中的E-box（5'-CANNTG-3'）和G-box（5'-CACGTG-3'）基序结合来调节下游基因的表达。 在电泳迁移率偏移测定（EMSA）中，ZmbHLH154与含有E-盒基序的探针结合，并且在存在未标记的竞争探针的情况下，偏移带的强度减弱（图4E）。我们还通过用一系列过表达ZmbHLH154的效应构建体转染玉米原生质体，使用ZmXTH1启动子驱动LUC转录，进行了荧光素酶（LUC）测定（图4C）。当ZmbHLH154表达时，源自ZmXTH1pro:LUC报告构建体的LUC活性显著升高（图4D）。这些结果表明ZmbHLH154作为转录因子发挥作用，正向调节ZmXTH1的表达。
图4 ZmbHLH154直接与ZmXTH1启动子结合并激活其转录表达。 A、 ZmXTH1基因启动子序列中典型和核心电子盒（CANNTG）元件的分布。 B、 ZmbHLH154的酵母单杂交分析与ZmXTH1启动子序列XTH1-1p（-2086~-1576bp）相互作用。 C、 荧光素酶活性测定中使用的效应子、报告子和参考构建体的示意图。 D、 LUC测定。ZmbHLH154激活靶向基因ZmXTH1。 E、 ZmbHLH154与ZmXTH1启动子中的E-盒元件结合的EMSA分析。 3.4 ZmbHLH154形成二聚体调节玉米节间伸长 由于bHLH家族中的转录因子通常以同源二聚体或异二聚体的形式发挥其功能，因此提出了ZmbHLH154是否也形成二聚体以发挥作用的问题。在玉米原生质体的共免疫沉淀（co-IP）测定中，ZmbHLH154 HA与ZmbHLH1 54 Flag相互作用。本氏烟草中的双分子荧光互补（BiFC）分析表明，ZmbHLH154在细胞核中形成同源二聚体。在下拉测定中，重组ZmbHLH154His与麦芽糖结合蛋白（MBP）-ZmbHLH154结合，但不单独与MBP结合。 通过酵母双杂交（Y2H）筛选，我们确定ZmIBH1与ZmbHLH154相互作用（图5A）。BiFC测定和Co-IP测定证实ZmIBH1是ZmbHLH154的相互作用伴侣（图5B，C）。总之，这些结果表明ZmbHLH154可以与其自身形成同源二聚体，并在细胞核中与ZmIBH1形成异二聚体。 为了探索异二聚体形成对ZmXTH1表达水平的影响，我们在玉米原生质体中进行了LUC报告子实验。与单独的ZmbHLH154相比，ZmIBH1和ZmbHLH1 54的共表达导致ZmXTH1pro:：LUC报告基因的LUC活性降低（图5D）。 RT-qPCR显示，在COR处理后6小时和24小时，COR显著抑制ZmIBH1的表达水平，这与ZmXTH1表达水平的变化相反。值得注意的是，当ZmIBH1表达时，ZmXTH1启动子驱动的LUC活性水平也显著低于对照（图5D）。此外，在Y1H测定中，ZmIBH1与ZmXTH1启动子结合（图5E）。这些结果表明，ZmbHLH154和ZmIBH1之间的相互作用抑制ZmXTH1的转录激活和表达，从而抑制细胞伸长。
图5 ZmIBH1与ZmbHLH154相互作用并干扰其转录激活。 A、 ZmbHLH154与ZmIBH1在Y2H测定中的相互作用。 B、 BiFC显示了本氏烟草叶细胞中ZmbHLH154和ZmIBH1之间的相互作用。 C，Co-IP显示ZmbHLH154和ZmIBH1之间的相互作用。 D、 LUC测定。ZmIBH1转录抑制ZmXTH1的表达并抑制ZmbHLH154的转录激活。 E、 ZmIBH1的Y1H金酵母测定与ZmXTH1启动子序列相互作用。 为了检测ZmbHLH154在节间伸长中的作用，我们在ND101的背景下产生了由泛素启动子驱动的ZmbHLH1 54过表达系（ZmbHLH154 OE#1和ZmbHLH 154 OE#2），以及ZmbHLH2 54的突变体（ZmbHLH154-c1和ZmbHLH154-c2）。ZmbHLH154过表达植物的株高、穗高和基部节间长度显著增加（图6 a-D）。相反，与ND101中的突变体相比，zmbhlh154-c1和zmbhlh154-c2突变体表现出株高和穗高降低，基部节间长度缩短（图6 A-D）。此外，我们还观察了COR处理对ZmbHLH154过表达系和ND101的影响。野生型（ND101）的中胚轴长度减少了21.9%，ZmbHLH154过表达系的中胚柄长度分别减少了9.7%和12.7%，这表明ZmbHLH1 54过表达株对COR的敏感性低于ND101。因此，ZmbHLH154在调节节间伸长方面起着积极作用
图6 ZmbHLH154正向调节玉米节间伸长。 A、 具有过表达ZmbHLH154（OE#1，OE#2）和ZmbHLH154突变体的两个独立转基因系与在田间生长的野生型（ND101）的株高的比较。 B、 ND101、ZmbHLH154过表达植物和ZmbHLH154突变体中的穗高。 C、 ND101第7至第10节间、ZmbHLH154过表达植物和ZmbHLH154突变体的表型特征。 3.5 JA通过BZR1介导BR对细胞伸长的调控 在水稻中，关键BR信号传导成分OsBZR1通过直接与其启动子结合来抑制OsIBH1的表达，从而促进水稻叶关节细胞的伸长以调节叶角。为了确定玉米中是否存在类似的调节，我们在ZmIBH1启动子中鉴定了多个E-盒元件。 在EMSA测定中，ZmBZR1直接与ZmIBH1启动子片段结合，并且随着未标记竞争探针的添加，移位的条带变得较弱。LUC测定显示，如用ZmIBH1pro:LUC报告子测定的，ZmBZR1抑制ZmIBH1的转录。这些数据表明BR信号传导的关键因子ZmBZR1负调控玉米中ZmIBH1的表达。JA类似物COR通过JA信号通路影响植物生长发育。表油菜素内酯（eBL，活性BR）的应用诱导黄化幼苗的中胚轴伸长，而用COR处理的黄化幼苗显示出较短的中子轴。此外，当同时用eBL和COR处理时，黄化幼苗表现出与单独用COR处理的幼苗相似的表型。eBL诱导ZmXTH1的表达，但添加COR抑制其表达。这表明COR通过抑制BR信号传导来抑制细胞延伸相关基因的表达。 为了探讨JA抑制BR信号调节延伸的机制，测试了BZR1与JA信号通路中关键调控成分之间可能的相互作用。我们通过BiFC测定（图7A）和下拉测定（图7B，C）证实了ZmBZR1与ZmMYC2-4和ZmMYC-2-6之间的相互作用。为了探讨这些相互作用对蛋白质功能的影响，我们进行了EMSA测定。在同时存在MBP-ZmBZR1和MBP-ZmmMYC2-4或MBP-Zm MYC2-6的情况下，指示ZmBZR1-ZmIBH1结合的移位带的强度弱于仅存在MBP-BZR1的情况下产生的强度（图7D）。 进一步的分析表明，这些相互作用抑制了ZmBZR1对ZmIBH1的转录抑制活性，从而增加了源自ZmIBH1pro:LUC报告构建体的LUC活性水平（图7E，F）。总之，这些结果表明JA信号抑制ZmBZR1对ZmIBH1转录的转录调节活性，从而影响BR调节的细胞延伸
04 结论  我们提出了一个工作模型，其中JA通过抑制BR信号传导来负调控节间伸长（图8）。根据该模型，JA信号在植物中被激活后，ZmMYC2-4和ZmMYC-2-6被释放并与ZmBZR1相互作用，从而抑制ZmBZR1-ZmIBH1的转录抑制。然后，ZmIBH1通过与ZmbHLH154形成异二聚体来抑制下游基因ZmXTH1上的ZmbHLH1 54的激活，从而负调控细胞和节间伸长。这项工作为JA和BR串扰在调节玉米节间伸长中的作用提供了见解
图8 描绘茉莉酸通过介导油菜素甾体途径调节细胞伸长来影响玉米节间伸长的工作模型。 在正常条件下，ZmBZR1转录抑制ZmIBH1的表达，ZmbHLH154可以直接结合激活ZmXTH1的表达并促进细胞生长。当施加COR（JA模拟）时，JA信号被激活。然后ZmMYC2-46与ZmBZR1相互作用，抑制ZmBZR1ZmIBH1的抑制作用。ZmIBH1与ZmbHLH154形成异二聚体，并干扰其对ZmXTH1的激活，从而抑制细胞伸长并缩短玉米节间长度。 05 原文获取 原文链接： https:///10.1093/plphys/kiae217 PDF获取： https://www./h-nd-334.html |
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