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总状土木香（Inula racemosa Hook. f.）是菊科，旋覆花属多年生草本植物，作为传统中药被用于慢性结肠炎、胃肠道疾病等。NLRP3炎症小体被认为是炎症性疾病药物发现中一个有前途的治疗靶点，四川大学华西医院叶昊宇团队前期发现总状土木香提取物能够抑制NLRP3炎症小体激活，其中丰富的倍半萜内酯异木香内酯（IAL）是主要的生物活性成分，然而IAL活性弱、代谢稳定性差、溶解度有限等问题阻碍其在药物研究领域的进一步探索和发展。 2024年4月30日，四川大学华西医院叶昊宇/吴文爽团队在J Med Chem（IF=7.3）上发表题为“Novel
Isoalantolactone-Based Derivatives as Potent NLRP3 Inflammasome Inhibitors:
Design, Synthesis, and Biological Characterization”的文章，设计并合成了64个IAL衍生物，其中化合物49成为最佳先导药物，对THP-1细胞中尼日利亚菌素诱导的IL-1β释放显示出最有效的抑制功效，比IAL强约27倍，并表现出更高的代谢稳定性。重要的是，化合物49显著改善了DSS诱导的体内溃疡性结肠炎。机制上，化合物49与NLRP3 NACHT结构域中的半胱氨酸279共价结合，从而抑制NLRP炎性体的组装和激活。
值得注意的是，叶昊宇团队长期从事抗炎相关靶标的研究，基于靶标的活性小分子的发现及作用机制研究以及在此基础上的创新药物研究，小编前期报道过该团队近期发表的另一篇文章如下： 2024年2月7日，该团队在Science Advances（IF=13.6）发表了题为“NU6300 covalently
reacts with cysteine-191 of gasdermin D to block its cleavage and
palmitoylation”的文章，该研究通过对化合物库进行了筛选，发现NU6300是细胞焦亡的有效抑制剂。从机制上讲，NU6300共价修饰GSDMD中的C191以阻止其裂解和棕榈酰化，导致随后的GSDMD膜定位障碍。此外，研究证明NU6300给药可改善结肠炎和脓毒症，有望作为炎症性疾病的潜在干预措施。 文献解析： 1、64个IAL衍生物的合成 改造的出发点是基于天然丰富的倍半萜内酯 IAL，IAL是通过高效液相色谱从总状土木香根的PE提取物中获得，64个IAL衍生物的合成路线如下（图1）：
图1 64个IAL衍生物的合成 接着基于初始构效关系探索，并利用LPS/尼日利亚霉素处理的 THP-1 细胞中 IL-1β释放的抑制作用来评估目标化合物对 NLRP3 炎症小体的抑制效力，然后开展代谢稳定性研究，类药特性评价，最终确定化合物49成为最佳先导药物，对THP-1细胞中尼日利亚菌素诱导的IL-1β释放显示出最有效的抑制功效，并表现出更高的代谢稳定性，没有显著的毒性和脱靶效应（图2）。
图2 化合物49成为最佳先导药物 2、化合物49对巨噬细胞中NLRP3炎性体激活的抑制作用 鉴于化合物49在THP-1细胞中对尼日利亚菌素诱导的IL-1β释放具有有效的抑制活性，作者进一步验证了其对BMDM和人外周血单核细胞（PBMC）中NLRP3炎性体的抑制效力，发现化合物49在 BMDM和PBMC中对尼日利亚菌素诱导的IL-1β释放同样表现出显著的抑制作用。CCK8实验显示化合物49对THP-1 细胞、BMDM 和 PBMC这三种细胞系没有表现出显著的细胞毒性。WB显示化合物49能够以浓度依赖性方式抑制IL-1β和caspase-1、IL-18的分泌（图3）。
图3 化合物49抑制NLRP3炎性体激活 3、化合物49抑制NLRP3炎症小体激活诱导的细胞焦亡 NLRP3炎性体的激活会启动caspase-1的激活，随后裂解GSDMD的N端（GSDMD-NT），GSDMD-NT具有与磷酸肌醇和心磷脂结合的能力，导致细胞膜破裂，进而引起细胞焦亡和LDH释放。化合物49处理导致THP-1细胞和BMDM中GSDMD-NT的减少。此外，化合物49表现出对NLRP3炎性体激活诱导的LDH释放具有显著的抑制作用。这些结果表明化合物49可以抑制由NLRP3炎性体激活诱导的细胞焦亡（图4）。
图4 化合物49抑制NLRP3炎症小体激活诱导的细胞焦亡 4、化合物 49共价靶向NLRP3 NAHT结构域中的 Cys 279 NLRP3包含三个结构域：与ASC结合的PYD结构域、具有ATP 酶活性的NACHT结构域以及诱导自抑制的LRR结构域。前面的SAR研究证明了IAL中α,β-不饱和羰基部分对于有效抑制NLRP3炎性体的关键作用，鉴于有文献报道冬凌草甲素和木香冬内酯具有结构相似的α,β-不饱和羰基部分，作为 Michael 受体，与NLRP3的NACHT结构域共价结合，从而抑制NLRP3炎症小体激活，作者推测推测化合物49可能与NLRP3具有类似的相互作用。随后通过DARTS、CETSA证明了NLRP3 的 NACHT 结构域在与化合物 49结合（图5）。
图5 化合物49直接结合NLRP3 为了确定化合物49修饰的NLRP3 NAHT结构域中的特定氨基酸残基，作者将重组NACHT蛋白与化合物49一起孵育，然后进行LC-MS/MS分析，发现化合物49特异性结合NLRP3 NAHT结构域内的Cys279。为了进一步验证结合位点，作者构建HA-NLRP3 C279A 质粒，DARTS发现化合物49可以和HA-NLRP3结合，不能和HA-NLRP3 C279A结合。CoIP显示化合物49抑制HA-NLRP3和FLAG-NEK7之间的相互作用，但不影响HA-NLRP3 C279A和FLAG-NEK7之间的相互作用。分子对接显示NACHT 结构域中Cys 279与化合物49的α,β-不饱和羰基部分之间共价键的形成（图6）。
图6 化合物49 与NLRP3的NAHT结构域中的Cys 279结合 5、化合物49抑制NLRP3炎症小体的组装 鉴于化合物49和NLRP3之间的直接结合，作者评估其对NLRP3-ASC和NLRP3-NEK7之间相互作用的影响，这在NLRP3炎性体复合物的形成过程中至关重要。结果发现尼日利亚菌素显著增强了内源性ASC和NLRP3之间以及NLRP3和NEK7之间的相互作用，而用化合物49处理则抑制了NLRP3-ASC和NLRP3-NEK7之间的相互作用。此外，WB和免疫荧光分析显示，在尼日利亚菌素刺激之前用化合物49进行预处理显著减少了ASC寡聚化，而这种现象在NLRP3 KO THP-1细胞中不存在，这些发现表明化合物49可能阻碍NLRP3炎性体的组装（图7）。
图7 化合物49抑制NLRP3炎症小体的组装 6、化合物 49 改善 DSS 诱导的小鼠实验性结肠炎 为了确认化合物49是否通过抑制体内NLRP3炎症小体激活发挥治疗功效，作者采用了DSS诱导的急性溃疡性结肠炎小鼠模型，发现化合物4显著改善了DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的体重减轻、DAI评分和结肠长度缩短，缓解DSS诱导的小鼠结肠固有基底层增厚、隐窝数量减少、杯状细胞耗竭、粘膜严重损伤等特征。ELISA表明化合物49治疗降低结肠炎小鼠结肠组织中 IL-1β 和 TNF-α 水平。此外，Western blot显示化合物49有效抑制结肠炎小鼠结肠组织中caspase-1的激活（图8）。
图8 化合物49改善DSS诱导的小鼠实验性结肠炎 总结 作者基于前期的研究基础——天然倍半萜内酯异木香内酯（IAL）被确定为NLRP3炎症小体抑制剂的活性支架，基于此开发了一系列新化合物（1−64），发现化合物 49 被证明是最有前途的抗 NLRP3 药物，具有改善的活性、更高的代谢稳定性和更低的毒性。体外化合物49对THP-1细胞中尼日利亚霉素诱导的IL-1β释放表现出最有效的抑制功效，体内化合物49显著改善了 DSS 诱导的体内溃疡性结肠炎。机制上，化合物49可以通过共价结合NLRP3 NACHT结构域的Cys 279，直接靶向NLRP3蛋白，从而抑制NLRP3炎症小体的组装和激活（图9）。
图9 异木香内酯衍生物改善结肠炎机制图 参考文献 Zhao M, Ye N, Liu L, Zhang RJ, Li N, Peng J, Cai XY, Jiang XQ, Su KY, Zhang XL, Rao QR, Liu KJ, Deng DX, Peng AH, Tang MH, Chen LJ, Wu WS, Ye HY. Novel Isoalantolactone-Based Derivatives as Potent NLRP3 Inflammasome Inhibitors: Design, Synthesis, and Biological Characterization. J Med Chem. 2024 Apr 30. doi: 10.1021/acs.jmedchem.4c00357. Epub ahead of print. PMID: 38686671. |
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