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中药复方芍药汤（SYD）治疗湿热性结肠炎的疗效已得到证实，但其潜在机制尚待阐明。本研究旨在探讨SYD治疗湿热性结肠炎的疗效及作用机制。我们构建湿热结肠炎模型，并用SYD灌胃处理7天，通过临床指标和组织病理学检查评估SYD的疗效；通过ELISA和生化试剂盒检测炎症因子和氧化应激参数。我们还通过16S rRNA基因测序分析了肠道微生物组的变化，并使用靶向色氨酸代谢组学量化了血清吲哚衍生物；采用蛋白质印迹和免疫荧光法检测AHR、CYP1A1、STAT3和紧密连接（TJ）蛋白的表达；采用ELISA试剂盒检测结肠中抗菌肽（Reg3β和Reg3γ）的含量；采用免疫组织化学方法检测增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白的表达。SYD有效缓解了湿热结肠炎小鼠的症状，包括体重减轻、结肠缩短、疾病活动指数（DAI）升高、脾脏肿大和肠黏膜损伤。SYD显著降低结肠组织中IL-6、TNF-α、IL-1β和丙二醛（MDA）水平，同时增加IL-10和T-AOC水平。此外，SYD减轻了肠道微生物群的干扰，恢复了微生物色氨酸代谢产物的产生，显著提高结肠组织中AHR、CYP1A1和p-STAT3的蛋白水平，并升高IL-22水平。此外，SYD组Reg3β、Reg3γ、occludin、ZO-1和PCNA的表达水平升高。我们的研究表明，SYD通过重组肠道微生物群结构来改善湿热结肠炎，增强与肠道微生物群相关的色氨酸代谢，激活AHR/IL-22/STAT3途径，从而恢复受损的肠黏膜。 论文ID 实验设计
实验结果 我们采用高效液相色谱法从SYD中分离鉴定出6种有效成分。标准品和SYD样品的HPLC图谱分别如图1所示。精密度、样品回收率、重复性试验和稳定率结果表明，每种成分的峰面积和保留时间的相对标准偏差均低于5%（补充表S1-S4）。黄芩苷、芍药苷、黄芩素、肉桂酸、阿魏酸和甘草素六种有效成分的含量分别为11.02±0.20、10.87±0.12、3.24±0.08、0.67±0.01、0.20±0.003和0.08±0.004mg/g。 表1 芍药汤的组成
植物名称已在http://www.核对。
如图2B所示，除正常（NC）组外，其他五组的体重呈现出先增加后下降的模式。与NC组相比，模型组的小鼠随着时间的推移表现出显著的体重减轻、腹泻和便血症状，同时疾病活动指数显著增加（图2C）。此外，模型组的结肠长度也显著缩短（P＜0.001，图2D），脾脏指数升高（P＜001，图2E）。口服不同剂量的SYD后，这些症状得到了不同程度的缓解，与模型组相比差异显著。 随后，我们通过H&E染色评估了结肠组织的病理损伤（图2F）。结果显示，NC组小鼠结肠上皮完整，细胞形态正常。相反，模型组表现出结肠黏膜的实质性损伤，隐窝变形或缺失、上皮细胞丢失、结缔组织增生和炎症细胞浸润。值得注意的是，SYD处理的小鼠的结肠黏膜上皮损伤较小，并且基本上保留了形态结构。 表2 疾病活动指数的打分标准
图2 SYD可改善小鼠湿热性结肠炎。（A）动物实验设计。SYDH，SYD高剂量组；SYDM，SYD中剂量组；SYDL，SYD低剂量组；SASP，磺胺吡啶基团。（B）体重变化百分比，n=10。（C）疾病活动指数（DAI评分）。（D）结肠长度变化和结肠宏观图像，n=7。（E）脾脏指数，n=7。（F）结肠组织的H&E染色和组织病理学评分的显微镜图像（比例尺=200μm；放大200倍）。与NC组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。 我们检测了结肠组织中炎症相关细胞因子的变化。模型组结肠组织中IL-6、IL-1β和TNF-α水平升高（P<0.01），而IL-10水平显著降低（图3）。SYD处理显著恢复了这些细胞因子的水平，SYDM组显示出更显著的效果。此外，我们还评估了结肠组织中丙二醛（MDA）和总抗氧化力（T-AOC）的水平（图3）。模型组结肠组织MDA含量显著升高（P<0.01），T-AOC含量显著降低。与模型组相比，SASP和SYD治疗组MDA浓度显著降低，SYDM和SYDL组T-AOC水平显著升高。这些结果表明SYD具有强大的抗炎和抗氧化活性。
图3 SYD降低小鼠结肠炎症和氧化应激反应。（A–D）检测各组小鼠结肠组织中炎症因子（IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10）的水平。（E，F）各组小鼠结肠组织中MDA和T-AOC的水平。与NC组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。 我们应用16S rRNA基因测序技术分析了4组小鼠的肠道微生物组成。物种累积曲线是一种广泛使用的方法来确定样本量的充分性。如图4A所示，曲线逐渐变平，表明测序样本量足够。维恩图（图4B）显示，NC、Model、SASP和SYD组共享348个相同的OTU，而NC组有39个单独的OTU；Model、SASP和SYD分别有8个、9个和28个单独的OTU。维恩图描绘了四组肠道微生物群的结构相似性和差异性。接下来，我们评估了每组小鼠肠道微生物的多样性。与NC组相比，模型组小鼠的sobs和Shannon指数显著降低（P<0.05，图4C和D），表明结肠炎小鼠肠道细菌的数量和种类减少。SASP或SYD组肠道细菌的丰度和多样性均有不同程度的增加。此外，PCA和PLS-DA分析均显示，小鼠肠道微生物群的总体特征在各组之间存在显著差异，表明各组之间的微生物群结构发生了显著变化（图4E和F）。
图4 SYD调节肠道微生物群的多样性。（A）物种积累曲线。（B）肠道微生物群的维恩图。（C，D）alpha多样性指数，包括sobs和Shannon指数。（E）基于OTU的PCA分析。（F）PLS-DA分析。SYD，SYDM组。 我们进一步评估了各组小鼠的物种组成。如图5A所示，研究中检测到的肠道微生物主要属于厚壁菌门、拟杆菌门、疣微菌门和变形菌门。与NC组相比，模型组的疣微菌门和变形菌门的丰度升高，而拟杆菌门和软壁菌门的丰度降低（图5A–C）。然而，SYD处理降低了变形杆菌的丰度，增加了拟杆菌的丰度（图5A–C）。在属水平上，模型组中Acetatifactor、脱硫弧菌、螺杆菌和埃希氏杆菌的丰度增加，而Barnesiella、Anaerostipes、Clostridium_XIVa、乳杆菌和Eisenbergiella的丰度减少（图5B–D）。SYD处理后，阿克曼菌、拟杆菌、乳杆菌、Clostridium_IV、Oscillibacter、Clostridium_XIVa和Lachnospirace_incertae_sedis的丰度增加，而Acetatifactor、脱硫弧菌、螺杆菌和埃希氏杆菌的丰度降低（图5B–D）。线性判别分析确定了对组间差异有显著贡献的主要微生物群落。结果（图5E和F）表明，普雷沃氏菌、Anaerostipes和罗氏菌在NC组中的贡献更大（LDA≥4）；变形菌、Acetatifactor和脱硫弧菌对模型组的影响更大（LDA>4）；而阿克曼菌和疣微菌门（门到科）在SYD组中的影响更大（LDA>4）。
图5 肠道微生物群结构和物种差异分析。（A，B）门（A）和属（B）水平的相对丰度直方图。（C，D）门（C）和属（D）水平上肠道微生物群的差异分析。（E，F）基于LEfSe分析的LDA评分图（E）和分支图（F）显示，肠道微生物种类在各组之间存在显著差异。SYD，SYDM组。 我们使用靶向代谢组学来检测小鼠血清中与肠道微生物群相关的色氨酸代谢产物的变化，特别是吲哚衍生物的变化。模型组血清L-色氨酸水平较NC组下降（P＜0.05）。此外，吲哚衍生物的浓度，包括IA、IAA、IAA-Asp（吲哚-3-乙酰基-天冬氨酸盐）、IAld、3-indolglyoxylic
acid、IPA和吲哚磺酸，表现出降低的趋势（P<0.05，图6）。数据指出，结肠炎小鼠经历了与肠道微生物群相关的色氨酸代谢紊乱。然而，与模型组相比，SYD逆转了这些色氨酸代谢物的水平，这意味着SYD可能通过调节与肠道微生物群相关的色氨酸代谢来发挥治疗作用。相关性分析显示，色氨酸代谢产物与乳杆菌、瘤胃球菌和Clostridium_sensu_stricto呈正相关（图7B）。上述代谢产物与促炎因子和MDA之间存在负相关（图7A）。
图6 SYD调节肠道微生物群相关的色氨酸代谢。（A）小鼠血清中色氨酸及其代谢物的定量（NC、模型、SASP和SYDM组）。（B）色氨酸代谢途径。IA，吲哚丙烯酸；IAA，吲哚-3-乙酸；IAld，Indole-3-carboxaldehyde；IGA，3-Indoleglyoxylic acid；IPA，3-吲哚丙酸；IAA-Asp，吲哚-3-乙酰基-天冬氨酸盐；IS，吲哚磺酸；Trp，L-色氨酸；IPYA，吲哚-3-丙酮酸盐；ILA，吲哚-3-乳酸；IAM，吲哚-3-乙酰胺。与NC组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。
为了研究SYD对肠上皮的保护作用背后的潜在机制，我们对结肠组织中与AHR/IL-22途径相关的蛋白质表达进行分析。相对于NC组，模型组结肠显示AHR及其靶基因CYP1A1的表达显著降低（P<0.01，图8A）。与AHR一致，模型组的IL-22水平明显低于NC组（P<0.01，图8B）。SYD显著逆转了这些变化。之后，我们对结肠进行了额外的分析，以研究STAT3和磷酸化STAT3的表达水平。在SYD组中，p-STAT3与STAT3的比例显著增加（图8C），表明SYD可以通过激活AHR-IL-22途径增强STAT3的磷酸化。此外，我们还检测了结肠中抗菌肽的浓度。正如预期的那样，与模型组相比，SYD显著促进Reg3β和Reg3γ的分泌（P<0.05，图8D和E）。
图8 SYD激活AhR/IL-22通路。（A）结肠组织中AHR和CYP1A1的蛋白表达水平。（B）IL-22在结肠组织中的表达水平。（C）结肠组织中STAT3蛋白的磷酸化水平。（D，E）结肠组织中抗菌肽Reg3β和Reg3γ的水平变化。SYD，SYDM组。与NC组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。 为了进一步评估SYD对湿热结肠炎小鼠肠道上皮屏障的保护作用，我们评估了结肠中TJ蛋白的水平。与NC组相比，模型组的occludin和ZO-1降低（P<0.01，图9A-C），这导致肠道通透性升高。此外，模型组小鼠的隐窝内PCNA阳性细胞数量减少（图9D）。相反，SYD处理后ZO-1和occludin的水平恢复，低剂量SYD显示出优越的效果。此外，SYD治疗组的PCNA阳性细胞数量增加，表明SYD促进了模型小鼠上皮细胞的增殖状态，并加速了损伤的恢复。
图9 SYD改善了肠上皮屏障。（A）ZO-1和occludin在结肠中的蛋白质表达水平。（B，C）occludin和ZO-1的免疫荧光染色（比例尺=100μm）。（D）PCNA的代表性免疫组织化学染色图像。PCNA阳性染色，深褐色表示肠隐窝细胞核（比例尺=100μm）。与NC组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。 讨论 UC的主要表现包括大便稀、大便带黏液和血、里急后重和腹痛。中医将UC分为“泻痢疾”，湿热证是溃疡性结肠炎急性期的主要证型。然而，很少有研究探讨SYD对肠道代谢的影响，以及SYD如何协调肠道微生物群及其代谢以改善肠道屏障功能。此外，以湿热结肠炎为模型的研究相对较少，不能很好地反映中医方剂和证候的特点。在本研究中，我们的结果表明，SYD通过促进微生物相关的色氨酸代谢来激活AHR/IL-22途径，从而修复肠道屏障功能，从而改善湿热结肠炎。 环境因素和饮食结构是导致UC的重要因素。中国南方城市的夏季气候往往炎热潮湿，很容易滋生感染人体的细菌。此外，人们的饮食西化，包括高饱和脂肪、甜食、蛋白质和添加剂，会增加肠道炎症甚至癌症的风险。中医理论认为，饮食过多富含脂肪和甜食，会导致脾胃气失衡，运化紊乱，津湿内滞，湿邪在体内长期积聚而成热。肠内湿热胶结，容易引起腹泻，长时间会变成UC。与单纯DSS诱导的常见UC模型相比，我们建立的高糖高脂饮食和高温高湿环境诱导湿热证动物模型，给予3.5%DSS更适合UC湿热证的临床特点。先前的研究表明，富含脂肪的饮食和高温高湿的气候会加重DSS诱导的结肠炎。我们对模型小鼠临床症状的评估显示，与NC组相比，体重显著减轻，DAI评分升高，结肠缩短，结肠黏膜广泛损伤，这表明SYD对湿热结肠炎具有保护作用。此外，UC患者和动物模型都表现出显著的炎症反应和免疫功能障碍。促炎细胞因子分泌增加是IBD的标志之一。我们的研究结果显示了SYD的抗炎作用，包括测量IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-10。此外，我们研究中的SYD干预组没有表现出剂量依赖性，SYD高剂量组的效果较差，可能是因为高剂量的适口性较差，影响了小鼠的吸收和利用。 多项研究表明，肠道微生物组在UC的发展中起着至关重要的作用。IBD患者和动物模型的肠道微生物群都表现出类似的变化，包括微生物丰度和多样性降低，以及潜在有益和有害微生物群之间的不平衡。与这些报告一致，我们的研究表明，结肠炎小鼠的肠道细菌种类显著减少，潜在有害群体增加，包括变形杆菌、脱硫弧菌、螺杆菌和埃希氏杆菌。脱硫弧菌可以还原硫酸盐产生H2S，H2S的积累会损害上皮细胞及其紧密连接。我们还观察到湿热结肠炎小鼠体内厚壁菌门含量较高，拟杆菌门含量较低，这可能与高糖和高脂肪饮食的摄入有关。被认为是益生菌的乳杆菌在模型组中的含量相对较低。事实上，乳杆菌被认为是益生菌，在保护肠道健康方面发挥着至关重要的作用。SYD处理增加了有益微生物群的水平，包括乳杆菌、阿克曼菌和Oscillibacter，同时抑制了脱硫弧菌、螺杆菌和埃希氏杆菌的增殖。阿克曼菌是一种肠道益生菌，与杯状细胞的数量呈正相关，有助于黏蛋白的分泌，从而有助于维持肠道屏障的功能。我们的研究表明，SYD可能通过重塑或恢复肠道微生物组的结构来调节肠道稳态。仅使用16S rRNA基因测序分析SYD对肠道微生物群的影响存在一些局限性。16S rRNA基因测序主要用于研究肠道微生物群的物种组成和物种多样性，我们可以从基因和肠道微生物群功能变化的角度进一步探索SYD对肠道微生物群影响的潜在机制。 除了肠道微生物群对宿主的直接影响外，许多微生物产物已被证明可以间接调节宿主的肠道免疫。来自肠道微生物的色氨酸代谢产物是肠道稳态的关键因素。色氨酸是一种必需氨基酸，可被肠道微生物群代谢为吲哚及其衍生物。乳杆菌、梭菌属、拟杆菌属和双歧杆菌属中的许多细菌都能产生吲哚乳酸和IAA。IAld可由各种乳杆菌（如约氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌）通过吲哚乳酸脱氢酶和芳香族氨基酸转氨酶的酶促作用产生。拟杆菌属和梭菌属中的一些物种可以产生吲哚、IPA和IA。重要的是，我们的数据显示，SYD处理提高了Clostridium_IV、Clostridium_XIVa、拟杆菌、真细菌、Parabacteroides、乳杆菌和Lachnospiracea_incertae_sedis的丰度，其中许多参与细菌色氨酸代谢。与此一致，我们注意到SYD的干预显著提高了结肠炎小鼠中L-色氨酸及其代谢产物的浓度，包括IA、IAA、IAld、3-indoleglyoxylic acid和IPA。先前的研究报道，在UC动物模型或IBD患者中，血清色氨酸水平降低，色氨酸向吲哚及其衍生物的转化率降低。我们的研究结果表明，SYD通过恢复微生物群相关的色氨酸代谢来缓解湿热结肠炎小鼠的症状。这种恢复过程可能与SYD对肠道微生物组的调节有关。 色氨酸代谢产物已被证明通过多种机制改善结肠炎，如减少炎症和改善上皮屏障功能。IA通过抑制单核细胞分泌IL-6和IL-1β并激活Nrf2信号传导，具有抗炎和抗氧化能力。Alexeev等人报道，IAld和IPA能够通过AHR介导的肠上皮细胞中的IL-10R1抑制炎症，从而维持肠道稳态。此外，IPA还作为PXR（孕烷X受体）的配体，减少TNF-α并调节上皮连接复合体。相关分析发现，色氨酸代谢产物的水平与IL-1β、IL-6、TNF-α呈负相关，并与IL-10的变化一致。我们的研究结果表明，SYD可能通过促进微生物色氨酸代谢产物的产生来减轻湿热结肠炎小鼠的炎症反应。 AHR是维持肠道屏障稳态的重要调节因子。基本上，大多数来自肠道微生物群的色氨酸代谢产物，包括IAA-IA、IAld，都是AHR的配体。这些代谢产物与AHR的结合刺激肠道中下游靶基因IL-22的产生。临床研究报告称，炎症性肠病患者炎症部位的AHR表达降低，粪便样本中AHR配体水平显著降低，这与我们的研究结果一致。此外，我们的研究结果表明，湿热结肠炎小鼠CYP1A1和IL-22的表达显著降低。对此的一种解释是，结肠炎期间肠道微生物群介导的色氨酸代谢途径的损伤导致AHR配体的产生减少，降低AHR和下游靶基因的表达。然而，SYD组AHR靶基因CYP1A1的显著恢复直接反映了SYD的AHR激活作用。此外，SYD显著改善了结肠炎小鼠的肠道屏障完整性，表现为紧密连接蛋白ZO-1和occludin的上调。这些结果表明，SYD可以通过恢复肠道微生物群相关的色氨酸代谢来激活AHR，从而提高肠道屏障的完整性，从而促进IL-22的产生。 IL-22对维持上皮细胞和防御病原体至关重要。此外，IL-22通过经典的JAK-STAT信号事件激活STAT3，并影响多种宿主上皮防御功能。肠黏膜损伤后，IL-22促进抗菌肽（AMP）的产生，并加速肠干细胞（ISCs）的再生以恢复上皮屏障。这是通过促进STAT3的Tyr705位点的磷酸化来实现的。我们的数据发现，SYD大大增强了STAT3的磷酸化。IL-22介导的STAT3激活可以进一步刺激隐窝的增殖，这与SYD干预组结肠隐窝中PCNA阳性细胞数量的增加一致。PCNA是增殖细胞核抗原，由于其在DNA复制中的重要作用，被认为是细胞增殖的分子标记。此外，SYD干预组还检测到AMPs Reg3β和Reg3γ的表达增加，这可以限制细菌在黏膜表面的定植，减少细菌移位以保护黏膜。我们的结果进一步证明，SYD促进IL-22分泌，刺激STAT3磷酸化，加速上皮细胞增殖，并进一步恢复肠道屏障结构和功能（图10）。
综合以上结果，我们可以提出SYD改善湿热结肠炎的潜在机制，首先，SYD恢复了肠道微生物稳态，特别是增加了阿克曼菌、拟杆菌和乳杆菌的丰度，然后恢复了微生物色氨酸代谢，促进吲哚衍生物如IAA、IA的产生，然后激活AHR信号调节IL-22/STAT3途径，改善肠道屏障。然而，本研究并没有完全阐明SYD的药效物质基础，通过HPLC仅鉴定出SYD中的6种化学成分。因此，在未来的研究中，我们将以这6种化学成分为基础，结合中药血清化学和中药代谢组学，研究SYD的有效成分群，进而进一步探讨SYD改善肠道屏障功能的机制。 结论 本研究采用高温高湿+高糖高脂+3.5% DSS相结合的方法构建湿热结肠炎小鼠模型。我们采用药效学、16S rRNA基因测序、靶向代谢组学和分子生物学技术相结合的综合策略，研究SYD治疗湿热结肠炎小鼠的作用机制。我们的研究结果表明，SYD减轻了湿热结肠炎小鼠的便血、腹泻和肠黏膜损伤症状，并抑制了肠道炎症和氧化损伤。SYD对湿热结肠炎的有益作用是通过调节肠道微生物群的结构和多样性来介导的，特别是增加阿克曼菌、拟杆菌和乳酸杆菌的丰度，然后恢复微生物的色氨酸代谢，最后激活AHR/IL-22/STAT3信号以修复肠道屏障功能。总之，我们的研究为SYD治疗湿热结肠炎的作用机制提供了新的见解，有利于其进一步的药物应用。 原文链接： https://pubmed.ncbi.nlm./38342152/  |
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